- ابتدا DNA الگو تقلیب (denature) می­ شود تا رشته­ های مکمل جدا شوند. دمای مورد نیاز برای این مرحله c°۹۴ می­باشد.

- در مرحله بعد واکنش، تا رسیدن به یک دمای اتصال (annealing) سرد می­ شود تا پرایمر­های الیگو نوکلئوتیدی بتوانند به DNA الگو متصل شوند. طی مرحله اتصال، DNA پلی­مراز مقاوم به حرارت فعال بوده و به محض اتصال پرایمر­ها بهDNA الگو، افزایش طول آن­ها را آغاز خواهد کرد. دمای مورد نیاز جهت اتصال پرایمر­ها °c72-40 (غالبا شروع با °c55) می­باشد.
- نهایتا واکنش تا رسیدن به دمایی نزدیک به دمایی نزدیک به دمای بهینه فعالیت آنزیم پلی­مراز حرارت داده می­ شود، که c°۷۲ دمای بهینه برای بسیاری از DNA پلی­مراز­های مقاوم به حرارت می­باشد.
- تکرار سه مرحله بالا برای ۴۰-۲۵ بار، که بستگی به کاربرد­های خاص دارد.
نهایتا واکنش تا دمای اتاق یا C°۴ سرد می­ شود که بستگی به کاربرد محصول و نوع ترموسایکلر مورد استفاده دارد (کریمی و همکاران، ۱۳۸۳).
شکل۱-۱- واکنش زنجیره­ای پلی­ مراز(PCR)
۱-۲-۱۰- بیان ژن
بیان ژن فرایندی است که در آن اطلاعات بیولوژی درون ژن استفاده می‌شود تا یک محصول کاربردی از آن به­دست آید. محصول ژن­ها عمدتا پروتئین‌ها هستند و از محصولات غیر پروتئینی می‌توان به rRNA،tRNA،snRNA اشاره کرد. فرایند بیان ژن بوسیله تمام یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌ها (باکتری‌ها و غیره) انجام می­گیرد. مراحل مختلفی را می‌توان برای فرایند بیان ژن در نظر گرفت که عموما شامل رونویسی، اتصال RNA، ترجمه و تغییرات بعد از ترجمه یک پروتئین می‌باشد. تنظیم ژن به سلول این امکان را می‌دهد تا بتواند ساختار و کاربرد خود را کنترل کند و این مسئله پایه­ای برای تفاوت­های سلولی، دگرگونی (تکامل) و مهارت تطبیق ارگانیسم­ها با شرایط جدید است. تنظیم ژن همچنان می‌تواند به عنوان یکی از زیر لایه­ های تکامل در نظر گرفته شود چون­که کنترل زمان­بندی، مکان و مقدار ژن می‌تواند تاثیرات مهمی در عملکرد ژن­ها درون سلول یا کل ارگانیسم پرسلولی داشته باشد. در علم ژنتیک، بیان ژن یکی از مهمترین مسائل بنیادی است که کمک می­ کند تا ژنوتیپ به صورت فنوتیپ ظاهر شود. درواقع کدهای ژنتیکی که در رشته­ های DNA ذخیره شده ­اند به­وسیله بیان ژن تفسیر می­شوند و خصوصیات و نحوه بیان ژن باعث به ­وجود آمدن فنوتیپ در ارگانیسم خواهد شد (یزدی صمدی و ولی­زاده، ۱۳۸۰).
۱-۲-۱۰-۱- مراحل مختلف بیان ژن
الف- رونویسی
تولید یک کپی RNA از روی DNA را مرحله رونویسی می­نامند (یزدی صمدی و همکاران، ۱۳۸۰)، به عبارت دیگر واکنش رونویسی ساختن یک مولکول RNA می­باشد. این فرایند بوسیله ی RNA polymerase انجام می­ شود. نکته کلیدی آغاز رونویسی این است که یک آنزیم RNA پلی­مراز باید در جایگاه آغاز رونویسی که به وسیله پروموتر یا راه­انداز مشخص می­ شود، و درست در دست بالای ژنی که باید رونویس شود قرار می­گیرد. همانطور که در شکل ۱-۲ مشاهده می­ شود رونویسی با حضور الگوی ۳ DNA تنظیم می­گردد و DNAی الگو ترتیبی که نوکلئوتید­های منفرد به RNA پلیمریزه می­شوند را هدایت می­ کند. بنابراین رونوشت ۵RNA به شکل گام به گام ساخته می­ شود تا این­که در هر لحظه یک نوکلئوتیدRNA را به رشته RNA درحال تولید، اضافه شود. رشته RNA با رشته DNA اصلی (غیرالگو) یکسان است تنها با این تفاوت که در آن به جای تیمین(T) از اوراسیل(U) استفاده شده است. عمل رونویسی پس از رسیدن به یک توالی مشخص خاتمه می­یابد (مجد و همکاران، ۱۳۸۰).
شکل۱-۲: رونویسی- تولید یک کپی RNA از روی DNA.
در پروکاریوت­ها مولکول­های mRNA رونوشت مستقیم ژن­ها هستند (جز درارکی­باکتر­ها) و تقریبا بدون تغییر و همزمان با رونویسی عمل ترجمه آن­ها آغاز می­ شود. اما در یوکاریوت­ها مولکول­های mRNA پس از رونویسی عمل پردازش (شکل۱-۳) یا حذف اینترون­ها و اتصال اگزون­ها صورت می­گیرد.
شکل۱-۳: پردازش- مرحله حذف اینترون و اتصال اگزون­ها
ب- ترجمه
برای بعضی ژن­ها رونوشت RNA محصول نهایی بیان ژن است (شکل ۱-۴). در ژن­های دیگر این رونوشت دستخوش مرحله دوم بیان ژن یعنی ترجمه می­ شود. در حین عمل ترجمه مولکول RNA (که RNA­ی پیک یا mRNA نامیده می­ شود)، ساختن یک پلی­پپتید را هدایت می­ کند به­ طوری که توالی اسید­های آمینه­ی آن به وسیله­ توالی نوکلئوتیدی mRNA تعیین می­ شود، (که آن­هم از توالی نوکلئوتیدی ژن به­دست آمده است). هر سه باز ریبونوکلئوتیدی متصل به­هم یا تریپلت محل استقرار یک اسید آمینه خاص را تعیین می­ کند و تشخیص اسیدآمینه مربوط به هر تریپلت توسط رمز ژنتیک مشخص می­گردد. ساخت پروتئین کلید اطلاعات ژنتیکی است، در مورد همه ژن­ها نقطه پایانی بیان ژن ساختن یک مولکول RNA یا یک پلی پپتید است (یزدی صمدی و ولی­زاده، ۱۳۸۰).
شکل۱-۴: ترجمه- ساخته شدن پلی­پپتید
۱-۲-۱۱- واکنش نسخه­برداری معکوس^[۱۰۸]
اساس RT-PCR بر آنزیم نسخه­بردار معکوس، یک DNA پلی­مراز وابسته به RNA، و توانایی آن برای ساخت رشته DNAی مکمل (رشته اول cDNA) از روی mRNA الگو بنا شده است. واکنش نسخه­برداری معکوس را می­توان روی RNA کل سیتوپلاسمی و یا بر روی mRNA خالص­شده انجام داد. نکته مهم این است که DNA ژنومیک نیز می ­تواند به عنوان PCR عمل کند. یک کنترل مناسب جهت بررسی آلودگی واکنش با DNA ژنومی یک واکنش شاهد است که در آن مرحله نسخه­برداری معکوس انجام نشده است. بسیاری از کیت­های تجاری، خالص­سازی RNA کل و یا mRNA را با کیفیت بالا و عاری از DNAانجام می­ دهند، ولی می­توان در مراحل خالص­سازی RNA یک مرحله هضم با DNASE I عاری از RNASE (Rnase free dnase I) قرار داد.
مرحله بعدی تبدیل mRNA به رشته اول cDNA می­باشد. این کار اغلب با بهره گرفتن از پرایمر Oligo-dt انجام می­ شود که می ­تواند به دم پلی mRNA ۳´A یوکاریوت­ها متصل شود و امکان cDNA را از روی مولکول­های mRNA موجود در واکنش توسط آنزیم نسخه­بردار معکوس فراهم سازد. این کار را می­توان بر رویmRNA جدا شده از ستون و یا بر روی mRNA جذب شده بر روی یک بستر جامد انجام داد. در نهایت بررسی محصولات حاصل از تکثیر RT-PCR انجام می­ شود (کریمی و همکاران، ۱۳۸۳).
۱-۲-۱۱-۱- PCR به همراه نسخه­برداری معکوس (RT-PCR)
بررسی بیان ژن نیاز به تعیین دقیق میزان mRNA دارد، ولی اساس PCR تکثیر DNA است نه RNA اکنون سوال این است که چگونه می­توان از آن برای بررسی RNA استفاده کرد؟ برای این­کار ابتدا RNA را با بهره گرفتن از روش کاملا شناخته شده نسخه­برداری معکوس که در حالت طبیعی توسط ویروس­های RNA­ دار برای تبدیل RNAی ژنومی آن­ها به DNAدر داخل سلول میزبان به­کار می­رود، تبدیل به DNAمی­ شود (شکل ۱-۵). سپس تکثیر PCR بر روی cDNA (DNA مکمل Complementry) به­دست آمده می­گیرد (کریمی و همکاران، ۱۳۸۳).
RT-PCR استاندارد یک روش سریع، متنوع و فوق­العاده حساس برای بررسی بیان یک ژن مورد نظر ارائه می­دهد و هم­چنین می ­تواند اطلاعات نیمه کمی نیز درباره میزان بیان فراهم سازد.
شکل۱-۵: رونویسی معکوس- تکثیر PCR از روی cDNA
فصل دوم:
مروری بر پژوهش­های پیشین
۲-۱- ویژگی­های مرفولوژیک و رویشی
تحقیقات بسیاری در مورد ویژگی­های رویشی و مورفولوژیک گیاهان در ارتباط با تنش خشکی صورت گرفته است و اکثر آن­ها بر تاثیر بسیار زیاد تنش کمبود آب بر این صفات تاکید دارند. در مطالعه­ ای که توسط لی و همکاران (۲۰۰۷) صورت گرفت اثر تنش خشکی روی Populus przewalskii کاهش معنی­داری را در خصوصیات رویشی از جمله ارتفاع ساقه، قطر یقه، بیوماس کل، تعداد کل برگ و مساحت کل برگ مشاهده شد. هم­چنین مطالعه دیگری بر روی Q. ilex نشان داد که نسبت ساقه به ریشه در تیمارهای شدید خشکی کاهش یافت (سالوادور و همکاران، ۲۰۰۴). تاثیر تنش خشکی بین ژنوتیپ­های بادام تلخ از نظر وزن خشک (ساقه، برگ و ریشه) هم اختلاف معنی­داری مشاهده گردید (رحمانی و همکاران، ۱۳۸۵). در گیاه زیتون نیز نسبت وزن خشک به سطح برگ در تیمار بدون آبیاری نسبت به کنترل، افزایش یافت (سوفو و همکاران، ۲۰۰۵). در مطالعه­ ای که توسط جیمس^[۱۰۹] و همکاران (۲۰۰۵) بر روی گونه­ های مختلف Alnus sp. صورت گرفت، گونه ­هایی که تحت تنش خشکی بودند از نظر رشد طولی ساقه کاهش معنی­دار بیشتری نسبت به گونه­ های شاهد داشتند.
بررسی بر روی ۵ گونه مهم جنگلی در تارایی توسط رائو^[۱۱۰] (۲۰۰۸) نیز نشان داد که طی تنش خشکی تغییرات ارتفاع نهال و میزان بیوماس در این گونه­ ها متفاوت بود، به­ طوری که گونه­ Leucaena leucocephala به­عنوان متحمل­­ترین گونه عکس­العمل کمتری را نشان داد و گونه­ Albizzia lebbek بعنوان حساس­ترین گونه به خشکی، بیشترین کاهش را از لحاظ این پارامترها در برابر تنش کمبود آب نشان داد و سریع‌تر از ۴ گونه دیگر از بین رفت.
همچنین طی تحقیقی که پولوس و همکاران (۲۰۰۷) انجام دادند اثبات کردند که خشکی تاثیر معنی­داری روی خصوصیات رویشی گونه­ های بلوط مورد مطالعه داشت. به طوری که این مقادیر در گونه Q. sideroxyla بیشتر ازگونهQ. laceyi تحت تاثیر قرار گرفت و آن­ها به این نتیجه رسیدند که گونه Q. laceyi نسبت بهsideroxyla Q. مقاوم­تر می­باشد. وناتور^[۱۱۱] (۱۹۷۶) در مطالعه بر رویPinus cariabae مشاهده نمود که نهال­های حاصل از خانواده­های مقاوم به خشکی، با کاهش سطح برگ و بیوماس هوایی از کم شدن یا مصرف آب اجتناب می­ کنند.
مطالعه بر روی نهال­های Q. ilex و Cariaria nepalensis و Eucalyptus microtheca نیز نشان داد که طی تنش خشکی نسبت ریشه به ساقه، به دلیل افزایش میزان رشد ریشه نسبت به میزان رشد وزن برگ و ساقه در این گونه­ ها افزایش می­یابد که می ­تواند دلیلی برای تلاش گیاه برای دسترسی به آب و بقا باشد (سالوادور و همکاران، ۲۰۰۴ ؛ بارگالی و تیواری، ۲۰۰۴ ؛ سوسیلوتو و برنینگر، ۲۰۰۷).
در سال ۲۰۰۴ ژانگ و همکاران^[۱۱۲] در بررسی روی اکوتیپ­های مختلف صنوبر بر روی خاک­هایی با محتوای آب متفاوت به این نتیجه رسیدند که تغییر در مقدار آب سبب کاهش ارتفاع، سطح کل و تعداد کل برگ، و نسبت ریشه به ساقه می­ شود و در اکوتیپ­های مختلف مقدار این پارامترها کاهش یافت. مرچانت و همکاران^[۱۱۳] (۲۰۰۷) با بررسی ۶ گونه اکالیپتوس تحت شرایط کمبود آب کاهش معنی­داری را در ارتفاع گیاه، قطر و سطح برگ و SLA ۳ گونه از آن­ها مشاهده نمود ولی این پارامترها در گونه­ های دیگر معنی­دار نشد.
۲-۲- ویژگی­های فیزیولوژیکی
۲-۲-۱- محتوی نسبی آب (RWC)
در یک آزمایش که بین تیمارهای مختلف تنش خشکی بر روی دو گونه­ بلوط انجام گرفت، RWC برگ­ها تفاوت معنی­داری را نشان نداد ولی میزان بیوماس در گونه Q. ruber نسبت به Q. petraea طی استرس آبی عکس­العمل شدیدتری را از خود نشان داد ( گیگر و توماس^[۱۱۴]، ۲۰۰۵). تزارا^[۱۱۵] و همکاران (۲۰۰۳) با مطالعه بر روی گونه Lycium nodosum تحت تنش خشکی و شوری به این نتیجه رسیدند که افزایش این تنش­ها باعث کاهش میزان RWC می­ شود.
نتایج پولوس و همکاران (۲۰۰۷) بر روی دو گونه Q. laceyi و Q. sideroxyla حاکی از کمتر بودن میزان RWC برگ در حالت کنترل در Q. laceyi در مقایسه با Q. sideroxyla بود که مقاومت بیشتر Q. laceyi را در برابر خشکی نشان داد. شونفلد و همکاران (۱۹۸۸) بیان کردند که با افزایش تنش رطوبتی، RWC برگ­ها در گونه گندم کاهش پیدا می­ کند که علت کاهش محتوای نسبی آب، کاهش پتانسیل آب برگ و کاهش جذب آب از ریشه­ها در شرایط تنش خشکی می­باشد. سینگ و سینگ (۱۹۹۵) در بررسی تأثیر تنش خشکی بر روی گندم و ذرت در شرایط مزرعه ای گزارش کردند که افزایش شدت تنش خشکی سبب کاهش محتوای نسبی آب برگ می­ شود. هم­چنین مارتین و همکاران (۱۹۸۸) نیز در شرایط تنش خشکی، افت در محتوای نسبی آب ارقام متحمل و حساس ذرت را گزارش و بیان کردند کاهش در محتوای نسبی آب ارقام حساس به خشکی در شرایط تنش رطوبتی بیش از ارقام متحمل به خشکی است .
رامیرز-والیجو و کلی (۱۹۹۸) نیز بالا بودن محتوای نسبی آب در ارقام مقاوم به خشکی باقلا را گزارش کردند. سالوادور و همکاران (۲۰۰۴) با بررسی نهال­های Q. ilex در دو دوره ۵/۲ و ۵/۳ ماهه در پتانسیل آب ۶/۲ تا ۷۶/۲ مگاپاسکال و رویو و همکاران (۲۰۰۱) نیز با برررسی گونه Pinus halepensis در دو سال متوالی طی ۳ ماه، در ۴ تیمار کنترل، ضعیف، متوسط و شدید تفاوت معنی­داری را در میزان محتوی نسبی آب در تیمارهای مختلف کمبود آب مشاهده ننمودند. در تحقیقی که توسط رعنائیان و همکاران، (۱۳۹۲) بر روی گیاه توتون انجام گرفت، میزان محتوای نسبی آب در گونه­ های تحت تنش کاهش معنی­داری نسبت به گونه­ های شاهد داشتند. طی تحقیق که شریعت و عصاره در سال ۱۳۸۷ بر روی ۴ گونه اکالیپتوس تحت شرایط خشکی انجام دادند با افزایش شدت تنش خشکی در اثر کاهش پتانسیل آبی از ۱/۰- به ۲/۱- مگاپاسکال، شاهد کاهش معنی­داری در میزان RWC برگ هر ۴ گونه بودند (شریعت، ۱۳۸۷).
۲-۲-۲- عملکرد فتوسیستم II
سوزا^[۱۱۶] و همکاران (۲۰۰۳ ) در تحقیق بر روی گونه­ Vigna unguiculata تحت تنش خشکی به این نتیجه رسیدند که با افزایش تنش خشکی عملکرد فتوسیستم II ( (fv/fm کاهش یافت. پولوس و همکاران (۲۰۰۷( عکس­العمل­های فیزیولوژیک دو گونه­ Q. laceyi و Q. syderoxila را در ۵ زمان به مدت ۷ هفته در برابر استرس­های کم آبی مورد مطالعه قرار دادند و طبق نتایج گونه­ Q. syderoxila بردباری کمتری نسبت به خشکی نشان داد به­ طوری که میزان کلروفیل فلورسنس در هفته ۶ در این گونه کاهش پیدا کرد و کاهش این پارامتر در گونه­ Q. laceyi که یک گونه­ مقاوم شناسایی شد در هفته ۷ اتفاق افتاد. طی تحقیقی که پوپوویک^[۱۱۷] و همکاران در سال ۲۰۱۰ روی نهال­های Q. ruber انجام دادند، به این نتیجه رسیدند که طی تنش خشکی میزان fv/fm کاهش پیدا می­ کند، به طوری که در این بررسی عملکرد فتوسیستم II از همان تنش کمبود آب ضعیف سیر نزولی را در پی داشت.
بررسی تاثیر تنش خشکی در دو گونه­ P. khinjuk و P. mutica توسط رنجبرفوردویی^[۱۱۸] و همکاران (۲۰۰۰) تفاوت معنی­داری را از نظر میزان کلروفیل فلورسنس II در بین تیمار تنش کمبود آب و کنترل نشان داد که این تفاوت در گونه­ P. mutica بیشتر از P. khinjuk بود که حاکی از مقاومت بیشتر P. khinjuk است. بررسی روی نهال­های دو گونه Q. agrifolia , Q. lobata تحت شرایط استرس آبی تفاوت معنی­داری را از نظر فتوسنتز و عملکرد فتوسیستم II نشان داد، به طوری که نهال­های Q. agrifolia نسبت به Q. lobata تحت استرس بیشتری قرار گرفتند و این پارامترها در آن­ها بیشتر کاهش یافت (ماهال^[۱۱۹] و همکاران، ۲۰۰۹). در مطالعه متی^[۱۲۰] و همکاران (۱۹۹۶) تنش خشکی در هر دو گونه Q. ilex, Q. pubescens باعث کاهش در میزان عملکرد فتوسیستم II شد که این تفاوت معنی­دار در Q. ilex بیشتر از Q. pubescens بود. اپرون (۱۹۹۷) با بررسی تاثیر تنش خشکی روی دو گونه Cedrus atlantica و C. libaniدر دو پروونانس ترکیه و فرانسه بیان کردند که با توجه به اینکه کمبود آب باعث بسته شدن روزنه­ها می­ شود، این امر خود باعث کاهش فتوسنتز و عملکرد فتوسیستم II می­ شود که گونه C. libani در پروونانس ترکیه تفاوت معنی­دار بیشتری را در حالت استرس آبی نسبت به گونه Cedrus atlanticaاز پروونانس فرانسه نشان داد. حاجی میرزایی (۱۳۸۵) بر اساس نتایج به­دست آمده از آزمایش غلظت کلروفیل در برگ های نهال­های پسته وحشی گزارش نمود که با افزایش مدت زمان خشکی میزان غلظت کلروفیل در برگ­ها کاهش می­یابد که این حالت در مورد غلظت کلروفیل a، کلروفیلb ، مجموع کلروفیل a وb و نسبت کلروفیل a به b نیز مشاهده شد. به نظر می­رسد کاهش میزان کلروفیل تحت تنش به ­واسطه­ تجزیه آن است. همچنین مجموع رنگدانه­های a وb در گونه تاغ با افزایش تنش خشکی کاهش معنی داری را نشان می­دهد. نسبت کلروفیل aبه b با افزایش دفعات آبیاری در گونه تاغ به شدت کاهش یافت. به عبارت دیگر افزایش مدت زمان بین دو آبیاری به میزان بیشتری باعث کاهش کلروفیل aگردید (بالابندی۱۳۸۴).
دامسین و رامبال (۱۹۹۵) گونه Q. pubescens را در معرض خشکی تابستان قرار دادند و عملکرد فتوسیستم II را هم تحت نور و درجه حرارت شدید و هم در تاریکی اندازه ­گیری نمودند و مشاهده نمودند که تنها برگ­ها در نور و درجه حرارت شدید عملکرد فتوسیستم II آن­ها کاهش یافت و در تاریکی تغییری مشاهده نشد، بنابراین گونه مورد مطالعه را گونه ­ای بردبار به خشکی معرفی نمودند.
مزوروس و همکاران (۲۰۰۸) عکس­العمل­های فیزیولوژیکی گونه Q. petraea را در مقابل استرس­های خشکی و گرمایی مورد مطالعه قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که این استرس­ها، فعالیت­های فتوشیمیایی برگ این گونه را تحت تاثیر قرار داده و عملکرد فتوسیستمII نسبت به مشخصه­های رشدی برگ تغییرات بسیار کمتری داشت.
در تحقیقی که پوپوویک و همکاران (۲۰۱۰) بر روی نهال­های Q. robur تحت تنش انجام دادند، به این نتیجه رسیدند که عملکرد فتوسیستم II در خشکی کاهش پیدا کرد. مطالعات دیگر انجام گرفته بر روی Q. robur نیز همین نتیجه را اثبات نمود (مولچانوو^[۱۲۱]، ۲۰۰۹ ؛ روسنکویست و همکاران^[۱۲۲]، ۲۰۱۰).
۲-۲-۳- نشت الکترولیت (EC)
تحقیقی که سالوادور در سال ۲۰۰۴ انجام داد، دریافت که خشکی سبب افزایش نرخ نشت الکترولیت برگ و در نتیجه کاهش پایداری سلول‌های غشایی می­ شود. نادلر و همکاران (۲۰۰۷) ، ۴ گونه موز ( (Musa acuminate، مانگو(Mangifera indica L.) و زیتون(Olea europaea L.) و خرما (Phoenix dactylifera L.) را تحت رژیم آبیاری متفاوت قرار دادند و تفاوت معنی­داری در میزان EC ساقه در این گونه­ ها و تیمارهای مختلف آبی مشاهده نمودند. به طوری که با کاهش میزان آبیاری، مقدار نرخ نشت الکترولیت ساقه افزایش یافت.