µl 3.4
DEPC
۳-۶-۲- روش نرمال سازی نسبی بیان ژن ها
پس از انجام واکنش Real-time RT-PCR برای هر یک از ژن ها، داده هایی (Ct)که از دستگاه گرفته شد با بهره گرفتن از فرمول زیر نرمال سازی گردید. در این فرمول ΔΔCtبرابر است با Ct) ژن هدف منهای Ct ژن کنترل داخلی در هر تیمار زمانی (x)( منهای (Ct ژن هدف منهای Ct ژن کنترل داخلی در زمان صفر).
Expression Ratio = 2-ΔΔCt
ΔΔCt = (Ct,Target - Ct,ef1-α)Time X - (Ct,Target - Ct,ef1-α)Time ۰
منظور از زمان صفر در فرمول فوق، نمونه شاهد در زمان های متناظر است. طبق مراحل زیر نرمال سازی انجام شد:
- سی تی هر نمونه از دستگاه گرفته شد.
۲- دلتا سی تی محاسبه شد، بدین صورت که Ct هر نمونه کنترل داخلی از Ct نمونه اصلی خودش تفریق شد.
- سپس دلتا دلتا سی تی محاسبه شد، بدین صورت که دلتا سی تی هر نمونه از دلتا سی تی تیمار شاهد در زمان متناظر تفریق شد. در این فرمول راندمان ۲ درصد فرض می شود.
۳-۶-۳-آنالیز آماری بیان ژن ها
میزان بیان ژن های PR1, PDF1.2, VSP2 و LOX2 با بهره گرفتن از روش Real time RT-PCR نسبی محاسبه گردید. در حقیقت میزان بیان این ژن ها در فاصله های زمانی نمونه برداری، کمی شد و براساس اعداد بدست آمده نموداری با بهره گرفتن از برنامه Excel رسم و داده ها با بهره گرفتن از نرم افزار SPSS آنالیز شدند.
فصل چهارم: نتایج
۴-۱- آزمون های تشخیصی اولیه
پس از خالص سازی باکتری Pss، آزمون های تشخیصی اولیه بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و مولکولی انجام گرفت. واکنش های تولید لوان، تولید رنگ فلورسنت با بهره گرفتن از محیط کشت King,s B، واکنش فوق حساسیت روی توتون و شمعدانی و بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی مثبت (شکل ۴-۱) و همچنین آزمون اکسیداز منفی بود.
شکل ۴-۱- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی (تصاویر بالا) وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی (تصاویر پایین)
۴-۱-۱- استفاده از PCR جهت تشخیص Pss
در آزمون تشخیصی PCR با بهره گرفتن از جفت آغازگرهای B2 و B1 که اختصاصی باکتری Pss است یک قطعه DNA با اندازه حدود۷۵۰ جفت باز که مورد انتظار بود به دست آمد. بنابراین سویه مورد استفاده به عنوانPss شناسایی شد (شکل ۴-۲).
شکل ۴-۲- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با بهره گرفتن از جفت آغازگرهای B2 و B1، از چپ: مارکر، کنترل منفی، نمونه، کنترل مثبت
۴-۲- بررسی جمعیت باکتری پس از مایه زنی
به منظور بررسی میزان جمعیت باکتریPss در دو فاز مختلف رویشی و زایشی، گیاهان آرابیدوپسیس با غلظتcfu.ml-1 ۱۰۷ این باکتری مایه زنی شدند. بهترین رقت برای شمارش کلنیcfu.ml-1 ۱۰۴ تعیین شد. (جدول ۴-۱و شکل ۴-۳).
جدول ۴-۱- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی
فاز زایشی
فاز رویشی
زمان بعداز مایه زنی (ساعت)
۱۰۶× ۸۵/۱
۱۰۶× ۳/۲
صفر
۱۰۷× ۱
۱۰۵× ۹/۳
۲۴
۱۰۷× ۴/۲
۱۰۵× ۱/۴
