در آزمایشات صورت گرفته مرته تونه و همکارانش در شرایط آزمایشگاهی و هم چنین محیط زنده، آنتی بادی های ضد این مارکر اثر مهارکننده ایی بر سرطان کولورکتال از خود نشان دادند.در آزمایش آنها رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی^[۱۸] برای این مارکر در تومور مثبت بود در صورتی که در اکثر تست هایی که بروی بافت های طبیعی انسان صورت گرفته بودALCAMمشاهده نشد. با توجه به منفی بودن رنگ آمیزی بافت نرمال انسان و مشاهده فعالیت ضد توموری این مارکر بر سرطان کولورکتال در داخل بدن آنتی بادی scFvیک کاندیدای بالقوه جهت درمان سرطان کولورکتال معرفی گردید(مرته تونه و همکاران^[۱۹]، ۲۰۱۰).

هم چنین الگوی بیان این مارکر در بافت نرمال و توموری ، روده انسان و موش با بهره گرفتن از روش های ایمنوهیستوشیمی،فلوسیتومتری^[۲۰] و واکنش زنجیره ایی پلی مراز ترانس کریپتاز معکوس^[۲۱] مورد بررسی قرار
گرفت.در نهایت پس از بررسی صورت گرفته ALCAM را به عنوان یک مارکر بالقوه جهت اهداف درمانی برای سرطان کولورکتال معرفی کردند.(لوین و همکاران^[۲۲] ،۲۰۱۰)
بیان ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند .افزایش بیان در تومورهای با تمایز بالا ممکن است مشخص کننده نقش بالقوه این مارکر در مراحل اولیه تومورزایی باشد،از دست دادن این پروتئین نیز ممکن است با کاهش چسبندگی سلولی همراه شود ، نتیجه پتانسل بالقوه بالای
تومور در متاستاز خواهد بود.این نتایج از طریق آنالیز ایمونوهیستوشیمیایی ALCAM که بروی نمونه بافتی بیماران تحت درمان صورت گرفته بود بدست آمد.(مایکل تاچزی و همکاران، ۲۰۱۰؛سالمون اوفوری و جودی کینگ^[۲۳]،۲۰۰۸)
همچنین مشخص شده است که ریزش ALCAM در مراحل اولیه بیماری می تواند به عنوان یک مارکر تشخیصی دقیق برای شناسایی سریع بیمارانی که در معرض خطر پیشرفت بیماری هستند مورد استفاده قرار گیرد.(اماندا هنسن و همکاران^[۲۴] ، ۲۰۱۳)
این نکته مشخص گردیده است ALCAM در دو نوع تعامل سلول –سلول هموفیلیک ^[۲۵]و هتروفیلیک^[۲۶] به عنوان میانجی عمل می کند. مشخص شده گلیکوزیلاسیون^[۲۷] پس از ترجمه هیچ اثری بروی خاصیت اتصالی هموفیلیک ندارد.(گیادو اسوارت^[۲۸]،۲۰۰۲)
در مطالعاتی که جهت تهیه نقشه خانواده مولکلوهای ایمونوگلوبولین چسبنده سلولی ((Igfs صورت گرفته مشخص شده است که دومین های ناحیه C2 نقش بسیار مهمی در اتصال به لیگاند ایفا می کنند.) گیادو اسوارت و همکاران ،۲۰۰۲ ؛ کوین زن وهمکاران^[۲۹]،۱۹۹۹)
تجزیه و تحلیل سلول هایی با مجموعه مولکول های سطحی EpCAMhigh/CD44+ منجر شناسایی CD166 به عنوان مارکر بیانی اضافی متفاوت، که جهت جداسازی سلول های بنیادی به شناسایی سرطان در سرطان کولورکتال مفید می باشد شد.(پیه رو دالربا و همکاران^[۳۰] ،۲۰۰۶)
هم چنین پیشنهاد شده است که CD166 به همراه CD44 نیز می تواند نقش بالقوه ایی در سرطان کولورکتال انسانی ایفا کند زیرا سلول های موشی که برای هر دوی این ماکر ها مثبت بودند تومورزایی بسیار بیشتری در مقایسه با سلول هایی که تنها برای CD44 مثبت بودند داشتند.(کاترینا فانالی و همکاران^[۳۱] ،۲۰۱۴)
در بیشتر مطالعاتی که اخیرا بروی بافت های سرطان کولورکتال صورت گرفته گزارش شده است که از دست دادن غشایی CD166 و CD44 استاندارد(CD44s) با تهاجم و بدتر شدن وضعیت بقا در ارتباط می باشد.(توماس برونر و همکاران^[۳۲] ،۲۰۱۲)
هم چنین ترکیب مارکرهایCD166،CD44 و CD133 می تواند به طور موفق آمیزی جهت شناسایی بیمارانی که خطر متاستاز و عود بیماری در انها کم،متوسط و یا زیاد است در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال استفاده گردد.(یوسوکه شینوزووا و همکاران^[۳۳]،۲۰۱۳)
همچنین در طی آزمایشی دیگری مشخص شد که ALCAM غالبا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد ، که بر اهمیت آن در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.( ویچرت و همکاران^[۳۴]،۲۰۰۴)
بر اساس تحقیقی دیگری که بروی بیان CD166 صورت گرفت مشخص شد که موقعیت های مختلف سلولی این پروتئین ارزش تشخیصی متفاوتی دارند و بیان سیتوپلاسمی آن با نتایج تشخیصی بدتری همراه می باشد.هم چنین اینها متوجه شدند که بیان CD166 به صورت خاصی در انواع رده های توموری افزایش پیدا می کند.(چائو نی و همکاران^[۳۵]،۲۰۱۳)
بیان بالای CD166 به همراه P21 در نمونه برداری های قبل درمان با عود تومور و پیش بینی ضعیف در بیماران درمان شده با ۵-FU بر پایه شیمورادیوتراپی قبل عمل ارتباط داشت.البته برای تعیین نقش CD166 وP21 به عنوان نشانگرهای پیش بینی به پاسخ شیمورادیوتراپی قبل از عمل جراحی به مطالعات بزرگتر و کابردی تری در آینده نیاز می باشد.(سانگ هون سیم و همکاران^[۳۶]،۲۰۱۴)
در تحقیقی بروی نمونه های کولکتومی به دست آمده از سرطان کولون به منظور بررسی ماکر CD166 صورت گرفت مشخص شد که بیش از دو سوم نمونه ها CD166 را بیان می کنند.هم چنین بیان غشایی CD166 مرتبط با سرطان کولورکتال در قسمت کولون این سرطان بیشتر می باشد. (شهریار صفایی و همکاران،۲۰۱۳)
فصل ۳ : مواد و روش ها:
۳-۱ مواد مورد استفاده:
۳-۱-۱ باکتری مورد استفاده
برای این مطالعه در مرحله کلونینگ ژن دومینC پروتئین ALCAM از باکتری E.coli سویه TOP10 و در مرحله ی ساب کلونینگ از باکتری E.coli سویه BL21(DE3)استفاده شد . این باکتری ها ابتدا بصورت لیوفیلزه بوده و سپس برای استفاده از آن، پودر باکتری را به ۵ میلی لیتر محیط کشت مایع LB اضافه کرده و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز کشت می دهیم.
۳-۱-۲ آنزیم ها
از آنزیم های NcoI و XhoI که از شرکت فرمنتاز^[۳۷]خریداری و تهیه شدند و همچنین از آنزیم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ی Ligation استفاده شد. این آنزیم ها در دمایی ۲۰- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
۳-۱-۳ پلاسمید
برای مرحله ی ساب کلونینگ از پلاسمید بیانی (pet-28a ) استفاده شد . این پلاسمید دارای جایگاه های مختلف برای انواع آنزیم های محدود کننده می باشد که می توان ژن مورد نظر را به کمک آنها وارد پلاسمید کرد. این پلاسمید دارای پارامترهای بیان کننده و همچنین جایگاه های برش آنزیمی دلخواه است و همچنین ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین را دارا بوده که به باکتری ترانسفورم شده امکان زنده بودن و بقاء در محیط کشت حاوی کانامایسین را می دهد. جهت بیان قطعه ژن کلون شده در آن هم دارای پارامتر های بیانی مانند پروموتر lac می باشد که در حضور القاگرIPTG شروع به بیان ژن مورد نظر می کند. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a در شکل ۳-۱ نشان داده شده است.
شکل۳-۱ نقشه ژنی پلاسمید pet28
۳-۱-۴ آنتی بیوتیک ها
از آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین استفاده شد. که ابتدا این آنتی بیوتیک ها به غلظت مناسب رسانده شد و در تیوب های ۵/۱ میلی لیتری تقسیم گردید و سپس در شرایط دمایی۲۰- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
۳-۱-۵ کیت های آزمایشگاهی
از کیت های استخراج DNA از ژل و استخراج پلاسمید که از شرکت فرمنتاز تهیه و خریداری شدند استفاده شد. که این کیت ها در شرایط دمایی ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۳-۱-۶ ژل الکتروفورز
برای ساختن ژل الکتروفورز از پودر آگارز Low که از شرکت هیسپانلب^[۳۸] تهیه شد استفاده گردید و همچنین در ساختن ژل از رنگ اتیدیوم برماید و بافر TAE50X که آن را به یک ایکس رقیق نموده استفاده شد.
۳-۱-۷ مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان با درجه ی خلوص بیولوژی مولکولی تهیه گردید و در مراحل مختلف مطالعه از جمله تولید ژل الکتروفورز (SDS-page ) مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۱-۸ محیط کشت باکتری
در این مطالعه از محیط کشت های آگار و محیط کشت LBآگار جهت تکثیر و رشد باکتری استفاده شد.
۳-۱-۹ وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی استفاده شده در این مطالعه
۱- میکروتیوب های ۲/۰ ، ۵/۰ و ۵/۱
۲- لوله ی آزمایش ۱۶۰ × ۱۶ سیماکس
۳- پلیت یکبار مصرف ۱۰ سانتیمتری
۴- سمپلر در سایزهای مختلف
۵- نوک سمپلر آبی، زرد، کریستالی
۶- انکوباتور ساخت شرکت ممرت^[۳۹] ایالات متحده امریکا (شکل ۳-۲ )
شکل۳-۲ دستگاه انکوباتور
۷- اتوکلاو جهت ضد عفونی کردن وسایل پلاستیکی و محیط کشت ها(شکل ۳-۳)
شکل۳-۳ دستگاه اتوکلاو
۸- دستگاه فور جهت ضد عفونی کردن وسایل شیشه ای
۹- تانک الکتروفورز (SDS-Page )
۱۰- تانک الکتروفوز افقی
۱۱- دستگاه مولد ولتاژ (شکل ۳-۴ )