TDZ با افزایش انباشتگی و سنتز سیتوکینین‌های پورینی، تبدیل آدنین به آدنوزین را افزایش می‌دهد (کوپل^[۱۵۲] و همکاران، ۱۹۸۳)، همچنین مطالعات ویکتور^[۱۵۳] و همکاران (۱۹۹۹) نشان داد که TDZ کارکرد دوگانه‌ای در القاء جنین سوماتیکی دارد، فعالیت شبه سیتوکینینی آن تقسیم سلولی را افزایش می‌دهد و کمی فعالیت شبه اکسینی دارد که به نظر می‌رسد برای القاء جنین بسیار مهم است. همچنین باززایی مستقیم جنین‌‌های سوماتیکی از ریزنمونه رأس ساقه را تحریک کرده و در القای جنین‌زایی سوماتیکی در ریزنمونه‌ها یا گیاهچه‌های بذری در انواع گونه‌های گیاهی سرسخت مؤثر بوده است (سید‌کی و زاید^[۱۵۴]، ۲۰۱۱). با این حال‌، برای باززایی جنین‌های سوماتیکی در نخل روغنی زیان‌آور بوده است (راجش و همکاران^[۱۵۵]، ۲۰۰۳). TDZ همچنین برای القای جنین‌زایی سوماتیکی در نخل ماکائو ضروری بوده است، اما در ترکیب با۲,۴-D ، به طور قابل توجهی درصد توسعه کالوس‌ها افزایش داده است.

۷-۱-۶-۲ ویتامین‌ها
ویتامین‌ها مواد نیتروژن‌داری هستند که به مقدار بسیار کم برای عملکرد کاتالیزوری در سیستم‌ آنزیم‌‌ها به‌کار گرفته می‌شوند. ترکیبات ویژه‌ای مانند اسید‌های آمینه و ویتامین‌ها که در محیط کشت یافت ‌می‌شوند اثرات ژرفی بر سیستم‌های کشت بافت گونه‌های خاص و بهینه‌سازی ترکیبات تحریک کننده باززایی ارقام مقاوم دارند (بنسون^[۱۵۶]، ۲۰۰۰). ویتامین‌هایی از قبیل: تیامین^[۱۵۷]، نیکوتینیک اسید^[۱۵۸]، پانتوتنات پیریدوکسین^[۱۵۹]، فولات^[۱۶۰]، بیوتین^[۱۶۱] (گامبورگ و شایلوک^[۱۶۲]، ۱۹۸۱) به مقدار کم در کشت بافت گیاهی به منظور افزایش رشد آنها نیاز است (تورس^[۱۶۳]، ۱۹۸۹). در شرایط آزمایشگاهی سلول‌های گیاهی سنتز ویتامین‌ها را در مقادیر کمتر از حد مطلوب می‌سازند، در نتیجه محیط کشت اغلب با ویتامین‌ها به منظور افزایش رشد تکمیل می‌گردد (الخیری، ۲۰۰۱). تیامین یک کوفاکتور مهم در متابولیسم کربوهیدارات است و به عنوان یک عنصر مهم در محیط کشت در نظر گرفته می‌شود و بیوتین در واکنش کربوکسیلاسیون مهم است (الخیری، ۲۰۰۱).تیامین و بیوتین در مسیرهای بیوسنتزی مهم بوده و برای انتقال گوگرد به سیستئین از پیش‌ساز‌ها یک کوفاکتور مهم هستند (بیگلی، ۱۹۹۹). بررسی‌های انجام شده بر روی نخل خرما توسط الخیری (۲۰۰۱) نشان داده است که بهترین رشد کالوس و تشکیل جنین در محیط کشت حاوی ۵/ میلی‌گرم در لیتر تیامین به همراه ۲ میلی‌گرم در لیتر بیوتین به‌دست می‌آید.
۸-۱-۶-۲ اسید‌های آمینه
اسید‌های آمینه برای تحریک رشد سلول و تسهیل باززایی گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرند (محمد، ۱۹۹۶).‌-L گلوتامین تنها منبع نیتروژن است که می‌تواند با سرعت بیشتر از نیتروژن غیر‌آلی جذب شود (تام و همکاران^[۱۶۴]، ۱۹۸۰).
۹-۱-۶-۲ زغال فعال
زغال فعال در محیط کشت بافت برای بهبود رشد و ارتقاء مورفوژنز در طیف گستره‌ای از گونه‌ها استفاده شده است (وان و همکاران^[۱۶۵]، ۱۹۹۷). اغلب از آن برای بهبود رشد و نمو سلول استفاده می‌شود (پان و ون استیدن^[۱۶۶]، ۱۹۹۸). همچنین در ریز‌ازدیادی درختان با جذب ترکیبات باز‌دارنده در محیط کشت و کاهش متابولیت‌های سمی، ترشحات فنلی و تجمع ترشحات قهوه‌ای کننده نقش حیاتی دارد. با این حال، گزارش‌های وجود دارد که علاوه بر جذب مواد ناخواسته، ممکن است هورمون‌ها (ایبرت و تیلور^[۱۶۷]، ۱۹۹۰)، ویتامین‌ها (پان و ون استیدن، ۱۹۹۸) و یا یون‌های فلزی مثال ⁺⁺ Cu و ⁺⁺ Zn(وان وینکل و همکاران^[۱۶۸]، ۲۰۰۳) مورد نیاز در محیط کشت را جذب کند. از طرفی، زغال فعال در محیط کشت خرما ظاهراً از انتشار موادی که به طور معمول در محیط آزاد می‌گردند ممانعت می‌کند (ریونای و لنین_-کیپنس، ۱۹۷۴). در ریز‌ازدیادی، ترشحات فنلی بسیار معمول است و اغلب بر روی کشت‌ها تأثیر منفی می‌گذراند (توماس^[۱۶۹]، ۲۰۰۸). استفاده از ۳/۰ گرم در لیتر زغال فعال باعث افزایش قدرت زیست ریزنمونه‌ها در برگ نابالغ خرما شده است (عثمانی و همکاران، ۲۰۰۹) و منجر به افزایش اثر اکسین در محیط کشت، تغییر خواص محیط کشت در جهت کاهش جذب تنظیم‌کننده‌های رشد و دیگر ترکیبات می‌شود (خان و همکاران^[۱۷۰]، ۲۰۱۱). در مطالعه دیگری کاربرد۳ گرم در لیتر، صرفأ منجر به کاهش اکسیداسیون فنول‌ها شد (تی‌سرات^[۱۷۱]، ۱۹۸۴). دریوارت و د‌ولف^[۱۷۲] در سال ۱۹۹۳ گزارشات استفاده از زغال فعال در محیط کشت در ۱۰۵ گیاه گردآوری کردند که در ۹۰ مورد اثرات مثبت و در ۱۲ مورد اثرات منفی و در ۳ مورد اثرات منفی و مثبت گزارش شده است. دو جنبه منفی مهم زغال فعال، هیدرولیز ساکارز به گلوکز و فروکتوز کاتالیز شده و کاهش شدید pH بعد از اتوکلاو است (وان و همکاران، ۱۹۹۷).
۷-۲ کشت ریز نمونه
طیف گسترده‌ای از ریزنمونه‌های مختلف نخل خرما در کشت بافت مورد مطالعه قرار گرفته است.
۱-۷-۲ کشت ریز نمونه برگ
کالوس‌های توسعه یافته از برگ گیاهچه‌های بذری خرما بعد از چند ماه ریشه داد‌ند (شروئیدر، ۱۹۷۰). ایوانس و بلیک^[۱۷۳] (۱۹۷۷) دریافتند که تکامل ریشه‌های حاصل از ریز‌نمونه برگ خرما با حضور سطوح پایین گاز‌ها و اکسین‌ها افزایش یافته و با کاهش مواد معدنی و یا ساکارز کاهش ‌یافته است. ریزنمونه دمبرگ هنگامی که بر روی یک محیط با سطوح بالای اکسین کشت شد ظرف ۶ هفته آغاز به ریشه‌دهی کرده است (ایوانس، ۱۹۷۸). شروع ریشه‌دهی با حضور بالای سیتوکینین و یا سطوح کم ساکارز محدود نبود، اما اغلب در محیط‌های حاوی سطوح بالا ساکارز و سیتوکنین کاهش‌یافت. پولین و همکاران^[۱۷۴] (۱۹۷۹) تعدادی کالوس از قاعده برگ‌ها‌ی جوان نخل را به دست آورده است. جوانه‌های در منطقه الحاق بین برگ‌های جوان و ساقه ایجاد می‌شوند. ریشه‌های به دست آمده در MS با ترکیبی از سطوح پایین اکسین مانند ۲/۱ و ۳ میلی‌گرم در لیتر ازNAA ، IBA و IAA تکامل یافتند. شروئیدر و همکاران (۱۹۸۰) تشکیل کالوس‌ از دمبرگ خرما در محیط‌های به کار گرفته شده توسط استاراتسکی^[۱۷۵] (۱۹۷۰) با بهره گرفتن از فرمولاسیون مواد معدنی Y₃ (ایوانس، ۱۹۷۶) اشاره کرد.
زاید^[۱۷۶] (۱۹۸۱) روی ریز‌نمونه‌های از برگ درختان بالغ خرما، پاجوش‌ها، گیاهچه‌های بذری و گیاهچه‌های غیر‌جنسی، نشان داد که تنها کالوس‌های به‌دست آمده از واکشت‌ برگ از گیاهچه‌های بذری و گیاهچه‌های غیر‌جنسی کشت داده شده ریشه‌ تولید می‌کنند. کالوس از برگ‌های جوان ۴ تا ۸ ماهه تشکیل شد. برگ‌های جوان پاچوش رقم‌ ‌دگلت نور، برای باززایی گیاهچه از کشت سوسپانسیون جنین‌زا، حاوی ۱ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D و ۳۰۰ میلی‌گرم در لیتر زغال فعال، استفاده شد، که از هر ۱۰۰ میلی‌گرم کالوس جنین‌زا، ۱۰- ۲۰۰ جنین در ماه به‌دست آمد (افکای و همکاران، ۲۰۰۳). عثمانی و همکاران (۲۰۰۹) از برگ‌های جوان رأس پاجوش رقم دجلت‌بی، با بهره گرفتن از ۱۰ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D در مدت ۸ ماه، سوسپانسیون جنین‌زا به‌دست آورد. گوی و همکاران (۲۰۰۹) قطعات برگ به طول ۵ سانتی‌متر از گیاهچه‌های بذری رقم احمر^[۱۷۷] را جهت کالوس‌زایی در محیط حاوی ۵۴ میکرومول NAA کشت کردند، بررسی تغییرات سیتولوژیک کالوس‌های تولید شده در مدت ۶۳ روز، نشان داد که بعد از ۵ روز، تغییراتی در سلول‌های مزوفیل پهنک برگ رخ داد و سلول‌هایی با هسته‌های حجیم تولید شد. این سلول‌های تمایز نیافته ظرفیت بالایی برای تقسیم داشتند و در روز نهم، خوشه‌ای از سلول‌ها تشکیل دادند که بعد از ۱۲-۱۴ روز مشخص شد کالوس‌ هستند.
۲-۷-۲ کشت ریز نمونه بساک
گیاهان هاپلوئید برای تجزیه و تحلیل ژنتیکی (تظاهر ژن‌های مغلوب و تهیه نقشه‌ی ژنتیکی) و همچنین اصلاح ژنتیکی گیاهان زراعی (تولید گیاهان دیپلوئید هموزیگوس و به‌دست آوردن هیبرید‌های سوماتیکی از طریق امتزاج پروتوپلاست‌های) استفاده می‌شود (بونگا^[۱۷۸] و همکاران، ۱۹۸۸). تحقیقات بسیاری روی استفاده از هاپلوئید‌ها و دابل‌‌هاپلوئید‌های تولید شده توسط کشت دانه‌های گرده در گونه‌های درختی توسط چن^[۱۷۹]، ۱۹۸۸ و بونگا و همکاران، ۱۹۸۸ بررسی شده است. جنین‌زایی از بساک‌ها می‌تواند تحت تأثیر عوامل ژنتیکی و محیطی (پیش‌تیمار و محیط کشت) قرار گیرد.
برای اولین بار تولک در سال ۱۹۵۳ پی برد که دانه‌های گرده‌ی‌ گیاه بازدانه ژینکو در محیط کشت رشد کرده و ایجاد کالوس می‌کند. آزمایش‌های بعدی وی نشان داد که دانه‌ی گرده را در شرایط آزمایشگاهی می‌توان به گونه‌ای پرورش داد که به جای تولید سلول جنسی، نسج هاپلوئید تشکیل دهد. امروزه تولید گیاهان هاپلوئید در تعداد زیادی از گونه‌های گیاهی از طریق کشت بساک امکان‌پذیر شده است. برای گونه‌های درختی نهان‌دانگان، گیاهان هاپلوئید معمولاً از کشت بساک یا میکروسپور به‌دست می‌آیند. گاهی اوقات ساختار‌های جنینی مستقیماً از میکروسپور‌‌های منفرد خواهند روئید. در موارد دیگر میکروسپور، کالوس هاپلوئید تشکیل می‌دهد که ساقه‌های نابجا یا شبه جنین^[۱۸۰] تولید می‌کنند. مرحله‌ی نموی گرده و بساک در زمان کشت روی محیط غذایی در پاسخ‌دهی آن بسیار مهم است. بهترین مرحله نموی میکروسپور‌ها به منظور کشت در بیشتر گیاهان، مرحله‌ی قبل از اولین میتوز گرده، یعنی مرحله اواسط تا اواخر تک هسته‌ای میکروسپور است (پیکسا و همکاران، ۲۰۰۴). تیمارهای ‌تنشی مختلف برای جلوگیری از توسعه‌ی گامتوفیتیک و القای جنین‌زایی دانه‌ی‌گرده در میکروسپورها بکار گرفته می‌شوند (شهریاری و همکاران^[۱۸۱]، ۲۰۰۸).
پیش تیمار سرمایی بیشترین و مؤثرترین کاربرد را در کالوس یا باززایی هاپلوئید‌ها دارا بوده است. پیش تیمار بساک در القاء و پاسخ آندروژنی تحریک کننده ‌بوده است (ژنگ^[۱۸۲]، ۲۰۰۳). پیش‌تیمار سرمایی در بسیاری از گیاهان ازجمله در جو (دوکس و همکاران^[۱۸۳]، ۱۹۹۳)، چاودار (ایمنن و آنتلا^[۱۸۴]، ۱۹۹۹)، گندم (کوزیدنی^[۱۸۵] و همکاران، ۲۰۰۳)، تیموتی گراس^[۱۸۶] (گوا و همکاران، ۱۹۹۹)، سویا (رودریگز و همکاران^[۱۸۷]، ۲۰۰۵) مؤثر بوده است. فراوانی بالا توسعه کالوس در کشت بساک گیاهانی از جمله زردآلو^[۱۸۸] (پیکسا و همکاران، ۲۰۰۴)، کلم (آچار^[۱۸۹]، ۲۰۰۲) و کلم بروکلی (آرنیسون و همکاران^[۱۹۰]، ۱۹۹۰) پس از استفاده از شوک‌های حرارتی گزارش شده است. همچنین قرار دادن بساک‌های گونه‌های درختی نهان‌دانگان یا میکروسپور‌وفیل‌های بازدانگان در معرض شوک حرارتی یا سانترفیوژ قبل از کشت گاهی اوقات محرک نمو بافت یا جنین‌ از میکرسپور‌ ‌گردیده است (بونگا و مک‌اینیس^[۱۹۱]، ۱۹۷۵؛ چن و همکاران ۱۹۸۸ و فروغی-ور و ونزل^[۱۹۲]، ۱۹۸۹). قرار دادن بساک‌های نارگیل در دمای ۳۸ درجه نتایج مثبتی داده است (پرارا، ۲۰۰۸).
تنظیم‌کننده‌های رشد برای پاسخ آندروژنی نقش حیاتی دارند (دیو و دان‌ول^[۱۹۳]، ۱۹۸۸؛ پیکسا و همکاران، ۲۰۰۴). اکسین‌ها برای القای کالوس از کشت بساک گندم (بل و همکاران، ۱۹۹۳) هستند. برای تشکیل جنین در کلم بروکلی تنظیم‌کننده‌های رشد به تنهایی کافی بوده است (آرینسون و همکاران،۱۹۹۰). هم اکسین‌ها و هم سیتوکینن‌ها برای تولید کالوس از بساک‌های کشت شده مورد نیاز هستند (پیکسا و همکاران، ۲۰۰۴). با این حال، در یولاف^[۱۹۴] (راینز^[۱۹۵]، ۱۹۸۳)، برنج (شالیف و استولارز^[۱۹۶]، ۱۹۸۱) و تریتیکاله^[۱۹۷] (پوک و همکاران^[۱۹۸]، ۲۰۰۰) محیط کشت بدون تنظیم‌کننده‌های رشد فراوانی بالاتری از کالوس‌های مشتق شده از بساک ایجاد کرده است.
۱-۲-۷-۲ تولید گیاهان هاپلوئید مضاعف
گیاهان هاپلوئید مضاعف به دو صورت تولید می‌شوند. یک روش تولید طبیعی و به صورت دو برابر شدن خود به خودی کروموزوم‌ها و روش دیگر استفاده از تیمار‌های شیمیایی، مانند کلشی‌سین است. فراوانی کم دو‌برابر شدن کروموزوم‌ها به طور خود به خودی سبب شد که محققان از روش‌های مصنوعی و با بهره گرفتن از مواد شیمیایی، کروموزوم‌ها را دو برابر کنند. کلشی‌سین به عنوان عامل ضد میکروتوبولی به دلیل دو برابر کردن کروموزوم‌ها مورد اسقبال قرار گرفته است. لاین‌های اصلاحی ایجاد شده با بهره گرفتن از روش هاپلوئید‌های دو برابر شده کاملاً هموزیگوت و همگن خواهند بود (ادر و چالیک^[۱۹۹]، ۲۰۰۲؛ روبر و همکاران^[۲۰۰]، ۲۰۰۵؛ چانگ و کو^[۲۰۱]، ۲۰۰۹؛ گایگر^[۲۰۲]، ۲۰۰۹). فوستر و توماس (۲۰۰۵) گزارش دادند که این روش برای اصلاح لاین‌های دابل هاپلوئید برای بیش از ۲۵۰ گونه‌ی گیاهی گزارش شده است و بیش از ۳۰۰ رقم در ۱۲ گونه که از دابل ‌هاپلوئید‌ها مشتق شده ایجاد شده‌اند.
در میان عوامل ضد میکروتوبولی کلشی‌سین بیشترین کاربرد را در شرایط درون‌شیشه‌ای و شرایط طبیعی بر عهده دارد. هر چند در شرایط آزمایشگاهی از چندین علف‌کش از جمله آمینوپروفس-متیل^[۲۰۳]، اوریزالین^[۲۰۴]، تریفلورین^[۲۰۵] و پرونامید^[۲۰۶] استفاده شده است. تمام این ترکیبات به‌غیر از پرونامید، با اتصال به توبولین از تشکیل رشته‌های دوک و از تفرق قطبی طبیعی کروماتید‌های خواهری جلوگیری کرده و در نتیجه تعداد کرموزوم‌ها دوبرابر شده می‌شود (مورجان و فوسکت^[۲۰۷]، ۱۹۸۴). دوبرابر کردن کروموزوم در مراحل اولیه جنین‌زایی گامتیک با کلشی‌سین، پرونامید و غیره در محیط کشت القاء بساک و میکروسپور‌های کالوس‌زا و در محیط کشت باززایی با موفقیت انجام گرفته است. کشت بساک و میکروسپور می‌تواند با تیمار کلشی‌سین تحت تأثیر قرار گیرد. افزایش فراوانی جنین با توجه به تیمار کلشی‌سین در ارقام ذرت گزارش شده است (برنابا و همکاران^[۲۰۸]، ۱۹۹۹). وابستگی به ژنوتیپ در ارقام گندم (سوریانو و همکاران^[۲۰۹]، ۲۰۰۷)، ذرت (برنابا و همکاران، ۱۹۹۹) بیان شده است. تفاوت میان ژنوتیپ‌ها در پاسخ به کلشی‌سین ممکن است به روند تقسیم میتوزی در کشت مرتبط باشد (زکی و دیکنسون، ۱۹۹۱). کارآیی دو برابر کردن تریفلورین، اوریزالین یا APM در جنین ژینوژنیک پیاز از کلشی‌سین بالاتر بوده است (گوزابلس و اداموس^[۲۱۰]، ۲۰۰۴). این عوامل نه تنها روی درصد دوبرابر کردن تأثیر می‌گذارد بلکه در تمام روند ژنوژنیک یا آندروژنیک تأثیر می‌گذارند. وان و ویدهولم^[۲۱۱] (۱۹۹۵) بهبود ثبات ژنتیکی گیاهان دابل هاپلوئید در ذرت با فراوانی بالا از طریق تیمار کلشی‌سین بر جنین‌زایی کالوس‌هایی مشتق شده از میکروسپور را گزارش داده‌اند. مطالعات مختلف نشان داده است که بهترین غلظت تیمار و مدت زمان بر حسب گونه‌ی گیاهی متفاوت است. دو عامل فیزیولو‌ژیکی برای به دست‌آوردن پاسخ آندروژنی در ذرت مؤثر است، این دو عامل عبارتند از مرحله‌ی نموی میکروسپورها و وجود محرک با منشأ خارجی برای القای یک پاسخ آندروژنی است (رینولدز،۱۹۹۷).
کلشی‌سین بر افزایش تقسیمات متقارن، رکود در سنتز توبولین‌های ویژه دانه گرده و سازمان دهی‌ دوباره اسکلت‌های سلولی تأثیر می‌گذارد (شریعت‌پناهی و همکاران^[۲۱۲]، ۲۰۰۶). کلشی‌سین همچنین می‌تواند سبب کاهش اختلالات DNA کلروپلاستی (آبروی و همکاران^[۲۱۳]، ۱۹۸۹) یا حذف انتخابی میکروسپور‌هایی که دارای ناهنجاری هستند نیز بشود (بربانا و همکاران، ۱۹۹۱). استفاده از کلشی‌سین در طول پیش‌تیمار سرمایی و مانیتول تنها در ذرت (آنتون- میچد و بکرت^[۲۱۴]، ۱۹۹۷) و گندم (سوریانو و همکاران، ۲۰۰۷) مورد بررسی قرار گرفته است. در مطالعه اول، میزان جنین‌زایی افزایش یافت اما تأثیری بر دوبرابر شدن کروموزوم مشاهده نشد. در مطالعه دوم، اثر کلشی‌سین بر تولید گیاه سبز و درصد دوبرابر شدن وابسته به ژنوتیپ بود. در طی ۱۵ سال اخیر دستورالعمل‌هایی برای کاربرد عوامل ضد میکروتوبولی در شرایط آزمایشگاهی توسعه یافته است. تلاش به منظور بهبود دستورالعمل‌ها برای کاربرد در میکروسپور‌های جدا شده، در محیط کشت القاء ژینوژینسیس و بلافاصله پس از گرده‌افشانی در تلاقی‌های دور می‌تواند باعث افزایش تولید دابل‌هاپلوئیدی شود. عوامل ضد میکروتوبولی در اولین تقسیم میتوزی سلول در میکروسپور‌ها می‌تواند القاء جنین را سبب شده و دوبرابر شدن خود به خودی کروموزومی را منجر می‌شود (کاشا^[۲۱۵]، ۲۰۰۵). در میان عوامل ضد میکروتوبولی کلشی‌سین بیشترین کاربرد را در شرایط درون‌شیشه‌ای و شرایط طبیعی بر عهده دارد. در کلزا^[۲۱۶]، کاربرد کلشی‌سین و فراوانی بالای جنین‌زایی و دو‌ برابر شدن کروموزوم گزارش شده است (ژو و همکاران^[۲۱۷]، ۲۰۰۲). همچنین گزارش شده از کلشی‌سین می‌توان به عنوان یک جایگزین برای پیش‌تیمار حرارتی استفاده گردد (ژو و همکاران، ۱۹۹۶). با این حال، مطالعات انجام شده با طیف گسترده‌ای از غلظت کلشی‌سین در ذرت، نشان داد که اگر چه کلشی‌سین می‌تواند بر جنین‌زایی تأثیر گذارد اما القاء دو برابر شدن کروموزو‌ها یکسان نیست (ابرت و بارنابس^[۲۱۸]، ۲۰۰۴). میزان غلظت پایین و نسبتاً کم کلشی‌سین (۲۰۰ و ۳۰۰ میلی‌گرم در لیتر) و پیش تیمار سرمایی قبل از کشت در جنین‌زایی مؤثر بوده است (بربانا و همکاران، ۱۹۹۸). که پیش‌تر نتایج مشابهی در گندم (بربانا و همکاران،۱۹۹۱) و در سایر غلات دانه ریز مانند برنج (بارسلو و همکاران^[۲۱۹]، ۱۹۹۴) مشاهده شده بود. در کشت بساک ذرت ۶ غلظت مختلف (۰, ۱۰۰، ۲۰۰، ۲۵۰، ۳۰۰ و ۴۰۰ میلی‌گرم در لیتر) و ۴ زمان متفاوت (۰، ۳، ۶ و ۹ روز) و دو ژنوتیپ مختلف (DH5×DH7 و ETH-M82) مورد بررسی قرار گرفت. در ژنوتیپ DH5×DH7، کلشی‌سین در غلظت ۱۰۰ میلی‌‌گرم در لیتر به طور قابل توجهی بیشترین جنین‌های سوماتیکی و مدت زمان ۳ روز را تولید کرده است. در حالی که در شاهد (محیط کشت بدون کلشی‌سین) و ۴۰۰ میلی‌گرم در لیتر کلشی‌سین حداقل جنین‌ سوماتیکی را تولید کرده است. در ژنوتیپ ETH-M82 بساک تحت تیمار با ۳۰۰ میلی‌گرم در لیتر به مدت ۶ روز بالاترین میزان جنین سوماتیکی را تولید کرده است (پورمحمدی و همکاران^[۲۲۰]، ۲۰۰۷). در کلزا ۴ غلظت مختلف (۱۲۵، ۲۵۰، ۵۰۰، ۱۰۰۰ و میلی‌گرم در لیتر) و سه مدت زمان (۱۲، ۲۴ و ۳۶ ساعت) مورد بررسی قرار گرفت. بالاترین میزان باززایی در غلظت کم کلشی‌سین (۱۲۵ و ۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر) به مدت ۱۲ و ۲۴ ساعت به دست آمده است (پورمحمدی و همکاران، ۲۰۱۲).
۳- ۷-۲ کشت ریز نمونه جنین
کشت جنین شامل برداشت جنین استریل از بذر و کاشت آن در یک محیط غذایی استریل است (هودد، ۱۹۷۷). کشت جنین در بسیاری از برنامه‌های کاربردی بالقوه در تحقیقات گیاهی پیشنهاد می‌شود. همچنین این روش برای نجات جنین‌هایی که موفق به توسعه طبیعی در میوه یا دانه نشده‌اند و یا جنین‌های بدست آمده از هیبریداسیون بین‌گونه‌ای استفاده می‌شود (جانستون و استرن، ۱۹۵۷). به منظور کاهش دوره خواب طولانی مدت به علت مهار‌کننده‌های فیزیکی و یا شیمیایی موجود در میوه و یا دانه، ممکن است از کشت جنین استفاده شود (هودد، ۱۹۷۷). معمولاً جنین‌های خارج شده که عاری از مهار‌کننده‌هاست در شرایط درون‌شیشه‌ای بلافاصله جوانه می‌زنند. جنین جدا شده در مطالعات متابولیک نیز به عنوان ریزنمونه بکار گرفته می‌شود (راگون^[۲۲۱]، ۱۹۷۶). کشت بخش‌های مختلف از جنین جدا شده برای بررسی تکامل مریستم‌های اولیه، اندام‌زایی و تعامل بین اندام‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد (رابشلت و گس، ۱۹۷۴). کشت جنین در خارج از دانه اولین بار توسط هانینگ^[۲۲۲] (۱۹۰۴) انجام شد. از آن زمان به بعد به یک روش معمول تبدیل گردید.
شروع کالوس‌دهی و القاء جنینی در خرما و دیگر نخل‌ها، برای اولین بار توسط رابشلت (۱۹۶۲) مشاهده شد که روی جنین نخل روغنی کار می کرد. ریونی^[۲۲۳] (۱۹۷۹) گزارش داد که در نخل خرما از بافت غلاف لپه جنین در محیط‌ کشت حاوی NAA کالوس و ریشه‌ ایجاد شده است. از این کالوس‌ها همچنین اگر یک قطعه از غلاف لپه وجود داشته باشد می‌توان برای تکثیر و تمایز ریشه در زمانی که وا‌کشت‌ ‌شود استفاده کرد. عمار و بن‌بادس^[۲۲۴] (۱۹۷۷) از غلاف لپه نخل خرما جنین بذری جوانه‌زده در شرایط آزمایشگاهی کالوس‌های اندام‌زا به‌دست آوردند. رنودس و موراشیگ^[۲۲۵] (۱۹۷۹) ریزنمونه‌هایی از جنین نخل‌ شامادورا^[۲۲۶]، نخل بهشتی^[۲۲۷] و نخل خرما را در شرایط درون ‌شیشه‌ای کشت دادند. میوه سبز نخل خرما، دو تا سه ماه بعد از گرده افشانی برداشت شده بود و در یک محیط غنی شده با ۲,۴-D کاشته شد، و کالوس دانه‌دار کرم رنگ از آن ایجاد شدند. سپس این کالوس‌ها به یک محیط عاری از اکسین منتقل شدند که منجر به تکامل جنین‌های متعدد غیر‌جنسی گردید. جنین تخم بالغ در محیط‌های کشت مغذی حاوی زغال فعال با سطوح اکسین بالا، ۱۰ و ۱۰۰ میلی‌گرم درلیترNAA ، کالوس‌های دانه‌دار تولید کرد و کشت مکرر منجر به تشکیل گیاهچه خواهد شد (تی‌سرات، ۱۹۷۹). برای کالوس‌زایی از جنین نارگیل ترکیبی از سیتوکینن با دوز کم و اکسین با دوز بالا و همچنین وجود مقادیری از زغال فعال ضروری است (پرارا و همکاران، ۲۰۰۷). زائید و تی‌سرات (۱۹۸۴) چگونگی تولید کالوس‌های جدا شده از جنین‌ آراکاسه و جنین بذور بالغ ۳۸ گونه در محیط کشت MS حاوی ۳ میلی‌گرم در لیتر زغال فعال و با ۱۰۰ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D و ۳ میلی‌گرم در لیتر۲-iP بررسی کردند. کشت جنین در ۱۸ گونه‌ پس از واکشت مکرر به مدت شش ماه کالوس فراوان تولید کرد. زاید (۱۹۸۷) نیز جنین‌های نخل خرما را کشت داده و سپس نمو آنها را گزارش داده است.
۴-۷-۲ کشت ریز نمونه گل آذین
گل آذین گونه‌های متعددی در شرایط آزمایشگاهی کشت شده است (نش^[۲۲۸]، ۱۹۶۳). از سال ۱۹۷۳، چندین محقق برای کشت بافت گل آذین نخل خرما تلاش کردند. ریز‌نمونه‌های از گل آذین نر و ماده نخل روغنی در انواع محیط‌ها کشت داده شدند و معمولاً توسعه یافتند که تا حدود زیادی طبیعی است، اما کالوس به دست نیامد (اسمیت و تومس^[۲۲۹]، ۱۹۷۳). به نظر می‌رسد برای اخلال در رشد عادی استفاده سطوح بالایی از اکسین لازم است. همچنین این موضوع متعاقباً توسط ایوانس و بلاک (۱۹۷۷) تأیید گردید. تی‌سرات و همکاران (۱۹۷۹) و (۱۹۸۰) نشان دادند که کاربرد اکسین‌ها در شرایط درون‌شیشه‌ای به محیط کشت، فراوانی برچه‌ها از گل‌های نر خرما را ظاهرأ افزایش داده است. بقایای برچه نخل خرما ماده روی زنده ماندن گل‌های نر طویل شده و تبدیل شدن آنها کاملاً محسوس است (تی‌سرات، ۱۹۷۹). کالوس‌های ترد سفید معمولاً از رشته جوانه گل آغاز می‌شوند (تی‌سرات و همکاران، ۱۹۷۹). در برخی موارد، از ریز نمونه محور اصلی گل‌آذین نارگیل (ایوانس، ۱۹۷۸) و خرما (تی‌سرات، ۱۹۷۹) ریشه و جنین‌ تشکیل شده است. ریشه‌ در ریز‌نمونه‌های ساقه‌های گل‌آذین که فاقد بافت مریستمی بود آغاز نشده است. کشت گل آذین نخل خرما نیز تا حد زیادی توسط دیرا^[۲۳۰] (۱۹۸۱) مورد بررسی قرار گرفته است. آنها یافتند که پاسخ مورفولوژیکی وابسته به منشاء و مراحل فیزیولوژیکی ریزنمونه‌ها است. همچنین در ریز‌نمونه گل‌آذین ماده بالاترین نرخ جنین‌زایی مستقیم در کشت قطعات ۷-۱۰ سانتی‌متری گلچه‌‌ها، روی محیط کشت MSبا ۵ میلی‌گرم در لیتر ۲,۴-D، ۱ میلی‌گرم در لیتر ۲iP، ۵/۱ میلی‌گرم در لیتر ABA و ۵/۰ میلی‌گرم در لیتر آنسیمیدول^[۲۳۱] حاصل شده است (سیدکی و الداویاتی^[۲۳۲]، ۲۰۱۲).
۵-۷-۲ کشت آندوسپرم
آندوسپرم از آمیزش یک گامتوفیت نر و دو گامتوفیت ماده به‌وجود‌ آمده است. این پدید امتزاج دوگانه نامیده می‌شود که در نهاندانگان بسیار معمول است. بیش از ۸۰ درصد گیاهان گلدار، آندوسپرم‌ موجود در بذور در حال توسعه، وظیفه تغذیه جنین در حال رشد را بر عهده دارد (ویلیامز و دلاتور^[۲۳۳]، ۱۹۸۰). هر گونه اختلال در توسعه آندوسپرم ممکن است سبب سقط جنین و در نتیجه بذرهای عقیم گردد (جانسون و همکاران^[۲۳۴]، ۱۹۸۰) تریپلوئید‌ها معمولاً دارای دانه‌ی عقیم‌اند و این برای گیاهانی که در آنها دانه دارای ارزش تجاری است نامطلوب است. با این حال، در مواردی بی‌دانگی برای بهبود کیفیت میوه به عنوان مثال در موز، سیب، مرکبات، انگور و خربزه درختی یک صفت مطلوب است. گیاهان تریپلوئید رشد رویشی قوی‌تری نسبت به همتایان دیپلوئید خود دارا هستند. از این رو در گیاهانی که بخش رویشی آنها از لحاظ اقتصادی مفید است تریپلوئید‌ی مناسب‌تر است (باجوانی و رازادن، ۱۹۹۶). از طرفی در بین گونه‌های درختی، تریپلوئیدی نادر است. آنهایی که از طریق به‌نژادی تولید شده‌اند اغلب دارای صفات مطلوب هستند. ریز ازدیای در تریپلوئیدی دارای دو کاربرد مهم است: ۱- تکثیر تریپلوئید‌های عقیم و ۲- ایجاد تریپلوئید‌های جدید. به طور سنتی، تریپلوئید‌ها توسط هیبریداسیون بین تتراپلوئید‌ها برتر و دیپلوئید‌ها تولید می‌شوند. اولین گام در تولید گیاهان تریپلوئید‌ در روش‌های جدید، تیمار دادن به بذور جوانه‌زده، دانه‌ها، نهال و یا جوانه‌های رویشی با کلشی‌سین ‌است (چاکرابورتی و همکاران^[۲۳۵]، ۱۹۹۸). در بسیاری از موارد میزان القای تریپلوئیدی کم و تیمار طولانی مدت پر زحمت بوده، از طرفی هنگامی که تریپلوئید‌ها از تلاقی والدین دیپلوئید به وجود آیند در اکثر موارد ممکن است موفقیت‌آمیز نباشد و در تلاقی موفقیت‌آمیز، جوانه‌زنی و طول عمر نهال کم است (سیکدار و جولی^[۲۳۶]، ۱۹۹۵). علاوه ‌بر این، همه‌ی ‌تریپلوئید‌های تولید شده از لحاظ جنسی رفتار یکنواختی را نشان نداده‌اند که ممکن است به دلیل تفرق هر دو سطوح تتراپلوئیدی و دیپلوئیدی باشد (داندون^[۲۳۷]، ۱۹۹۰). تلاش برای رشد آندوسپرم در کشت بافت در اوایل سال ۱۹۳۰ و سپس آندوسپرم بالغ و نا‌بالغ از گونه‌های مختلف گیاهان گلدار (اتوتروف و همچنین انگل‌ها) با موفقیت انجام گرفت. لامپز و میلر^[۲۳۸] (۱۹۳۳، به نقل از لارو^[۲۳۹] ۱۹۳۶) برای اولین بار اقدام به رشد آندوسپرم نابالغ ذرت در محیط کشت حاوی عصاره سیب‌زمینی یا عصاره ذرت نابالغ کردند و تکثیر جزیی از سلول‌های نزدیک به جنین را مشاهده کردند. بعد‌ها لارو و همکارانش در دانشگاه میشیگان، ایالات متحده آمریکا تحقیقات گسترده‌ای در این زمینه انجام دادند. در سال ۱۹۴۹ لارو برای اولین بار امکان به دست‌آوردن مدام بافت‌های در حال رشد از آندوسپرم نابالغ ذرت کشت داده را گزارش داد (لارو، ۱۹۴۷، ۱۹۴۴). در واقع، لارو اولین کسی بود که تشکیل کالوس در یک گیاه تک‌لپه‌ای را گزارش می‌نمود. بعد‌ها بسیاری از افراد دیگر کشت آندوسپرم ذرت را با اهداف مختلف انجام دادند.
کشت بافت آندوسپرم در گیاهانی مانند :چچم (نوستاک، ۱۹۵۶)^[۲۴۰]؛ خیار (ناکاجیما، ۱۹۶۲)^[۲۴۱]؛ گندم (سهاگل، ۱۹۷۴)^[۲۴۲]؛ سیب (مو و همکاران، ۱۹۷۷)^[۲۴۳]؛ مرکبات (مانگ و چانگ، ۱۹۷۸)^[۲۴۴]؛ برنج (ناکانو و همکاران، ۱۹۷۵ و باجج، ۱۹۸۰)^[۲۴۵]؛ جو (سان و چو، ۱۹۸۱)^[۲۴۶]؛ مارچوبه (لیو و همکاران، ۱۹۸۷)^[۲۴۷]؛ آکاسیا (گارگ و همکاران، ۱۹۹۶)^[۲۴۸]؛ توت سفید (توماس و همکاران،۲۰۰۰)^[۲۴۹] گزارش گردید. ریز‌ازدیادی گیاهان تریپلوئید از طریق اندام‌زایی یا جنین‌زایی برای تعدادی از گونه‌های درختی انجام شده است (لاکشمی سیتا^[۲۵۰]، ۱۹۸۷). گیاهان تریپلوئید گردو^[۲۵۱] از طریق جنین‌زایی غیر جنسی در ریزنمونه‌های آندوسپرم به‌دست آمده‌اند (تولک و همکاران^[۲۵۲]، ۱۹۸۸). گیاهان پرتقال^[۲۵۳] تریپلوئید نیز از طریق جنین‌زایی در کالوس آندوسپرم به‌دست‌ آمدند. البته این گیاهان بسیار ضعیف‌تر از آن بودند که پس از انتقال به خاک زنده ‌بمانند. برای فائق آمدن بر این مشکل، جوانه‌های جانبی گیاهان تریپلوئیدی روی پایه‌های گیاهچه دیپلوئید پیوند شدند (گمیتر و همکاران^[۲۵۴]، ۱۹۹۰).
القای تقسیم سلولی و تکثیر آندوسپرم بالغ در ابتدا به عنوان یک کار دشوار در نظر گرفته می‌شد. اولین گزارش در مورد تکثیر آندوسپرم بالغ توسط رانگاسومی و رائو^[۲۵۵] (۱۹۶۳) در صندل سفید^[۲۵۶] سپس توسط (موهان رام و ساتسانی^[۲۵۷]، ۱۹۶۳) در کرچک^[۲۵۸] گزارش شده است. در ده‌های اخیر، کشت آندوسپرم در چندین گیاه دولپه‌ای و تک لپه‌ای انجام گرفته است. گیاهانی که بهترین پاسخ را به این نوع کشت داده اند، اغلب از تیره‌های فرفیون^[۲۵۹] (افوربیاسه)، صندل (سانتاسه^[۲۶۰])، دارواش (لورانتاسه^[۲۶۱]) می‌باشند.
انتخاب محیط کشت مناسب یا مکمل‌های دیگر از عوامل تعیین کننده موفقیت نمو گیاهان تریپلوئید است. محیط کشت پایه MS عمدتاً برای شروع و بهبود پاسخ در شرایط آزمایشگاهی کشت آندوسپرم مورد بررسی قرار گرفته است. اکثر کشت‌های آندوسپرم نارس نیاز به حضور یک یا چند تنظیم‌کننده‌ رشد برای باززایی دارند به‌جز گیاه جعفری، که در آن محیط پایه MS برای جنین‌زایی آندوسپرم مناسب است (مسعودا و همکاران، ۱۹۷۷). در اکثر گزارش‌ها اکسین ترجیحاً۲,۴-D برای القای کالوس‌زایی ترجیح داده شده است. در صورتی که در گیاهان انگلی رشد مطلوب کالوس بر روی محیط حاوی سیتوکینن و یا در ترکیب با اکسین رخ داده است. سایتوکینین‌های مختلفی برای تحریک تولید جوانه از آندوسپرم آزمایش شد‌ه‌اند. ثابت شده است که در اغلب گیاهان ۲ip موثر‌ترین نوع سایتوکینین از این نظر است. این درحالی است که در کشت آندوسپرم کیوی، TDZ تنها سایتوکینن محرک اندام‌ هوایی می‌باشد. در گیاهان اتوتروف ترکیب سیتوکینین و اکسین ضروری است. در بسیاری از موارد، زمان مورد نیاز برای تکثیر شروع از ۱۰ تا ۲۰ روز متفاوت است. در گونه کیوی^[۲۶۲] شروع کالوس‌زایی در محیط MS حاوی ۵٫۷۸ میکرومولار۲,۴-D و ۲۳٫۲۵ میکرومولار کینتین رخ داده است (مکنا و پوارا^[۲۶۳]،۱۹۹۷). در مالتوس^[۲۶۴] کالوس به طور مداوم بر روی محیط کشت MS حاوی ۵/۲ میکرومولار کینتین و ۷۸/۵ میکرومولار ۲,۴-D به‌دست آمده است. در آنونا^[۲۶۵] کالوس‌زایی بر روی محیط WM (وایت^[۲۶۶]، ۱۹۶۳)که با دو سیتوکینین کینتین، BAو یک اکسین NAA و جیبرلیک اسید رخ داده است (نایر و همکاران^[۲۶۷]، ۱۹۸۶). در برنج، تفاوت معنی‌‌داری بین پاسخ رشد آندوسپرم بالغ و نابالغ وجود دارد. آندوسپرم نابالغ دو حالت تمایز وجود دارد. باززایی مستقیم از ریز‌نمونه یا به طور غیر مستقیم از طریق مرحله کالوس در آندوسپرم بالغ اندام‌زایی ساقه همیشه قبل از مرحله کالوس‌زایی بوده است. کالوس‌زایی از آندوسپرم بالغ بر روی محیط MS که با ۹ میکرومولار ۲,۴-D تکمیل شده آغاز شده است (باجج و همکاران، ۱۹۸۰). در پرتقال^[۲۶۸] شروع کالوس‌زایی از آندوسپرم روی محیط MT (موراشیگ و تاکر^[۲۶۹]، ۱۹۶۹) و WM رخ داده است. اما فراوانی کالوس‌زایی از آندوسپرم بیشتر در محیط کشت MT که با ۰۶/۹ میکرومولار ۲,۴-Dو ۲۰/۲۲ میکرومولار BA تکمیل شده بود رخ داده است (ونگ و چانگ، ۱۹۷۸). در جعفری^[۲۷۰]، کالوس‌های جنین‌زا و جنین‌ها توسط کشت آندوسپرم از جوانه‌های جوانه زده در محیط پایه MS به‌دست آمده است (مسعودا و همکاران، ۱۹۷۷). در اقاقیا^[۲۷۱] آندوسپرم نابالغ بر روی محیط کشت پایهMS که با ۵/۲ میکرومولار۲,۴-D و ۵/۲ میکرومولار BA تکمیل شده بود تولید کالوس دانه‌دار کرده است. بعد از سه واکشت بر روی محیط کشت مشابه و انکوبه کردن در تاریکی جنین‌های سوماتیکی تشکیل شده است (گارگ و همکاران،۱۹۹۶). آندوسپرم نابالغ چریش^[۲۷۲] کشت داده شده روی محیط پایه با ۵ میکرومولار۲,۴-D تکثیر کالوس رخ داده، اما بهترین محیط کالوس‌زایی روی محیط ۵ میکرومولار NAA، ۲ میکرومولار BA بر روی محیط پایه MS رخ داده است (چیتوویدی و همکاران^[۲۷۳]، ۲۰۰۳).
فصل سوم
مواد و روش‌ها
فصل سوم مواد و روش‌‌ها
۱-۳ زمان و محل انجام آزمایش
این پژوهش در سال ۱۳۹۳-۱۳۹۲ در آزمایشگاه بیوتکنولوژی و کشت بافت دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان انجام شد.
۲-۳ تجهیزات آزمایشگاهی
۱-۲-۳ تهیه ترکیبات مختلف، محلول‌های پایه و محیط‌های کشت
الف- تهیه ترکیبات و مواد مختلف، تهیه محلول پایه ماکرو المنت^[۲۷۴] و میکروالمنت‌های^[۲۷۵] غذایی و نگهداری آن‌ها در شیشه‌های تیره در یخچال در دمای C˚۴، همچنین تهیه محلول پایه هورمون‌ها و نگه‌داری آن‌ها در دمایC˚۲۰- انجام گردید.
ب- آماده سازی و سترون کردن محیط‌های کشت.
لازم به ذکر است که محیط‌های کشت آماده شده را می‌توان همان روز استفاده کرد و در غیر این صورت در یخچال در دمایC˚۴ به مدت ۴ هفته قابل استفاده می‌باشند، بعد از این مدت نباید از آن‌ها استفاده کرد. محیط‌های تهیه شده را در اتوکلاو با دمای C˚۱۲۱ و فشار PSI 15 (5/1 اتمسفر) برای مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه قرار می‌دهند تا استریل شوند. مواد حساس به حرارت از جمله آنتی اکسیدانت‌ها و تنظیم‌کننده‌های رشدی از قبیل TDZ و IAA به دمای بالای اتوکلاو حساس بوده و باید بعد از اتوکلاو به محیط کشت شده افزوده شوند. این مواد با فیلتر سرسرنگی ۲۲/۰ میکرومتر، در زیر هود لامینار سترون شدند. محلول فیلتر شده در دمای C˚۲±۲۰- قابل نگهداری است.
۲-۲-۳ ابزار و وسایل مورد نیاز برای تهیه و نگه‌داری محیط کشت:
استوانه مدرج جهت به حجم رساندن، ترازو‌های دیجیتال با دقت ۰۱/، ۰۰۱/۰، ۰۰۰۱/۰ گرم جهت توزین آگار، ساکارز، موادشیمیایی، ویتامین‌ها و هورمون‌ها، قاشک جهت برداشت مواد، هات پلیت، همزن مغناطیسی جهت هم‌زدن ترکیبات محیط کشت، پیپت در حجم‌های مختلف، الکل اتیلیک، pH متر جهت تنظیم اسیدیته، فویل آلومینیومی جهت پوشش وسائل به هنگام استریل کردن، اتیکت جهت مشخص نمودن هورمون‌ها، محیط‌های کشت و تاریخ تهیه آن‌ها و نام تهیه کننده.
۳-۲-۳ اتاق رشد
در اتاق رشد دما، رطوبت، جریان هوا و کیفیت و طول مدت نور به خوبی کنترل می‌شود. اکثر کشت‌ها در این اتاق در دمای ۲۵± درجه سانتی‌گراد تحت فتوپریود ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریک نگهداری شدند. الف- نور: نور اتاق رشد باید از نظر کیفیت و کمیت تنظیم شود. در اتاق رشد نگهداری کشت‌ها، لامپ‌های مهتابی (فلورسنت) باید به تعداد کافی باشد تا شدت نور لازم برای رشد ریزنمونه‌ها را تأمین نماید. میزان شدت نور بسته به گونه گیاهی، نوع ریزنمونه و هدف آزمایش متغیر می‌باشد. شدت نوری بین ۴۰۰ تا ۲۰۰۰ لوکس در نظر گرفته شود، اما به طور کلی نور لازم توسط لامپ‌های فلورسنت با شدت نور Lumen/Watt 45- 75، به تعداد دو لامپ به ازای هر ۵۲/۰ متر مربع (حدوداً معادل ۳۴۵۷-۶۹۱۴ لوکس به ازای مساحت ذکر شده، طبق فرمول lx= W×(Lm/W)/m² تامین شد (پالمر^[۲۷۶]، ۱۹۹۹).
ب- دما: به طور کلی، اتاق رشد برای رشد نمونه‌های کشت باید دمایی بین ۲± C˚۲۵ درجه داشته باشد. به همین جهت، وجود یک دستگاه ثبت دما به طور پیوسته در اتاقک رشد لازم است تا نوسان‌های دمایی اتاق مشخص شود. هر چه دمای اتاق در تمام طول رشد نمونه‌ها ثابت‌تر باشد مناسب‌تر است.
پ- رطوبت: رطوبت بالای هوا در اتاقک رشد باعث افزایش آلودگی می‌شود بنابراین باید از آن پرهیز شود. رطوبت پایین نیز احتمالاً روی تبخیر آب از شیشه‌های کشت آزمایش تأثیر می‌گذارد. بنابراین اتاقک رشد باید دارای تهویه با فشار به طور نسبتاً یکنواخت بوده و رطوبت آن بین ۶۰ تا ۷۰ درصد و قابل کنترل تا ۳± درصد باشد.
ت- اکسیژن: تهویه نیز عامل مهمی برای رشد سلول‌ها و بافت‌ها می‌باشد.
ث- دی‌اکسید‌کربن: در ظروف در بسته تبادل گازی کم است. بنابراین به صورت عادی CO₂ کم و اتیلن زیاد است. با کاهش غلظت CO₂ میزان فتوسنتز در گیاهچه‌های کشت شده در درون شیشه محدود می‌شود. چون در محیط درون شیشه‌ای شدت نور کم و در نتیجه فتوستنز پایین است، نیازی به افزودن CO₂ وجود ندارد و معمولاً بیشتر نیاز به هیدرات‌کربن از طریق افزودن ساکارز تأمین می‌شود.
۳-۳ تهیه مواد گیاهی