۱ـ۲ . عدم وجود بیماری
۲ـ۲٫ احتمال وجود آنتی بادی های بلوکان که در این صورت بایستی آزمایش تیترکومبس رایت(Coombs Wright) انجام گیرد.
الف: تیتر کومبس رایت با رقت ۳ برابر بالاتر از رایت به عنوان بیماری فعال تلقی میگردد.
ب: تیتر کومبس رایت با رقت کمتر از ۳ برابر رایت معمولا بیماری فعال نیست.
۳ـ۲ در مناطقی که امکان آزمایش کومبس رایت وجود ندارد میتوان از دو آزمایش متوالی رایت با فاصله دو هفته بعد از آزمایش اولیه استفاده کرد که درصورت افزایش چهار برابر و یا بیشتر تیتر آگلوتیناسیون بروسلا، بیماری فعال و باید تحت درمان قرارگیرد.
روش های تشخیص بیماری که در بالا ذکرشد عمدتاً در مناطق شهری میتواند مورد استفاده داشته باشد و در جامعه روستایی یا در مشاغل دامپزشکی، دامداری، قصابی و… که احتمال تماس با آنتی ژن بروسلا در آنها بالا می باشد (با نگاه به بیماری به عنوان یک بیماری شغلی)، بطور قاطع نمیتوان تیتر عنوان شده را مطرح نمود، لذا با توجه به وجود عوامل اپیدمیولوژیکی، علائم بالینی همراه با معیارهای آزمایشگاهی، پزشک تصمیم گیرنده نهایی برای درمان بیماران خواهد بود.(۱۸)

در تشخیص بروسلوز انسان، در نظرگرفتن توأم اطلاعات اپیدمیولوژیکی، بالینی و آزمایشگاهی ضروری است.از آنجایی که جداسازی بروسلا از بافت ها دلیل قطعی عفونت در بدن می باشد، در حد امکان کشت خون،مغز استخوان یا دیگر نسوج بایستی انجام شود. درصورت نتیجه منفی کشت، تیتر مثبت آزمایش STAT در بیماری تب دار حاد شاهد قوی برای تشخیص مثبت خواهد بود.
از آزمایش رزبنگال میتوان به عنوان روش پشتیبانی مقدماتی، بویژه در نواحی آندمیک استفاده نمود، اما خواه مثبت خواه منفی نتایج بایستی بوسیله آزمایشهای دیگر تأیید شود.
در بیماران مظنون به بروسلوز با کشت منفی و تیترهای ضعیف آزمایش STAT میتوان آزمایشهای کومبس CF (ثبوت مکمل) یا ELISA انجام داد(۲۲)، که در برخی آزمایشگاه های تشخیص طبی انجام می شود، هنوز بخوبی استاندارد نشده است.
در بروسلوز حاد انسانی، ابتدا IgM افزایش می یابد و گاهی IgM تنها ایمونوگلوبولینی است که در هفته های اول بیماری یافت می شود و میزان آن در عرض سه ماه پس از شروع عفونت افت می کند. در حالیکه آنتی بادیIgG از هفته دوم به بعد شروع به افزایش می کند و در موارد درمان نشده، به مدت حداقل یک سال در حد بالائی باقی می ماند ولی در بیمارانی که بنحو کاملی درمان شده اند میزان آن در عرض شش ماه تا یک سال پس از شروع بیماری به حداقل رسیده و یا کاملا محو می گردد. طی عفونت مجدد یا تشدید(Exacerbation) عفونت قبلی عیار آنتی بادی IgG و احتمالا آنتی بادی IgM ضد بروسلائی، افزایش می یابد و مطالعات اخیر، حاکی از آنست که طی عود بروسلوز، فقط IgG افزایش می یابد.در مورد حیوانات، واکسیناسیون با سویه های خشن (B. abortus RB51 برای واکسیناسیون گاوها ) و(۱B. melitensis Rev برای واکسیناسیون بزها و گوسفندها) موجب برانگیخته شدن آنتی بادی هایی می شود که به شکل پایدار در حیوان باقی مانده و تشخیص بروسلا به روش سرولوژی را دچار اختلال می کند. تفاوت آزمون های مختلف سرولوژی، در توانایی آنها در تشخیص ایزوتایپ های مختلف آنتی بادی ها است. بر حسب مرحله بیماری، آزمون خاصی را باید انجام داد(۵، ۲۶، ۳۳).
۲-۷-۲٫ انواع تست هاى سرولوژیک بروسلوز:
سازمان بهداشت جهانی برای تشخیص این بیماری،۷ آزمایش سرولوژیکی استاندارد زیر را توصیه نموده است:
۲-۷-۲-۱ تست آگلوتیناسیون داخل لوله ای استاندارد ( (SATیا Standard Tube Agglutination Test) ) یا تست رایت این تست IgM و IgG را مورد ارزیابی، قرار می دهد.تست رایت متداول ترین تستی است که مورد استفاده قرار می گیرد و حدود ۹۷% موارد بروسلوزی که از طریق کشت، به اثبات رسیده است به وسیله این تست، عیار افزاینده چهار برابر یا بیشتر را نشان می دهد .
۲-۷-۲-۲ تست آگلوتیناسیون ME2 : این تست IgG را بررسی می نماید.تست ۲ - مرکاپتواتانول(۲ME)نوعی آزمایش آگلوتیناسیونی است که در حضور ۲ - مرکاپتواتانول، صورت میگیرد.این ماده باعث غیر فعال شدن مولکول های IgM می شود و تاثیر خود را از طریق متلاشی کردن پیوند های دی سولفیدی مولکول IgM اعمال می نماید .
۲-۷-۲-۳٫ تست آنتی گلوبولین یا کمبس رایت: عمدتا نشان دهنده آنتی بادی های کلاس IgG است.
۲-۷-۲-۴٫ تست فیکساسیون کمپلمان ( ثبوت مکمل ) : نشان دهنده آنتی بادی های کلاس IgGمی باشد.
۲-۷-۲-۵و۶٫ تست های رادیوایمونواسی و ELISA: حساسیت و ویژگی آنها نسبت به تست استاندارد و فیکساسیون کمپلمان بیشتر است و نشان دهنده هر دو ایمونوگلوبولین M و G می باشند. آنتی بادی های اختصاصی ضد بروسلائی نوع IgM، IgG و IgA را می توان به روش رادیوایمونواسی، مورد بررسی قرارداد.
۲-۷-۲-۷٫ تست رزبنگال: رینگ تست و آگلوتیناسیون روی لام که روش های آگلوتیناسیون سریع (Rapid) می باشند: اساس این آزمایش عبارتست از مخلوط کردن حجم های مساوی آنتی ژن و سرم و مشاهده آگلوتیناسیون حاصله بعد از زمان معین و نتیجه این آزمایش، رابطه مستقیمی با نتیجه فیکساسیون کمپلمان دارد.آزمون رز بنگال یا تست کارد یک آزمون سریعی است که برای غربالگری استفاده می شود اما نتایج آن همیشه باید به وسیله ی تست های دیگری مانند SAT و یا کشت خون تأیید شود( ۱، ۲، ۲۵، ۲۶).
۲-۷-۳٫ تشخیص بروسلوزیس بر اساس روش های مولکولی:
به خوبی شناخته شده است که آزمایش های سرولوژیکی همیشه حساس و اختصاصی نیستند.نتایج مثبت کاذب آزمون های سرولوژیکی در میان گاوها در مناطق عاری از بروسلوزیس تنها به واسطه ی یرسینیا اینتروکولیتیکا ۱۵ % است. و همچنین نتایج منفی کاذب نیز در تشخیص بروسلوزیس مشاهده می شود؛ که عمدتاً ناشی از این حقیقت است که پاسخ آنتی بادی وابسته به مرحله ای از عفونت است که در آن نمونه برداری انجام می شود.به طور کلی حساسیت وسیع، اختصاصیت پایین در مناطق اندمیک، ناتوانی در تشخیص حالت های مزمن و رجعت بیماری، حضور آنتی بادی های متقاطع و نبود آنتی ژن های استاندارد شده در آزمایش های سرولوژیک عرصه را برای ورود روش های ملکولی فراهم کرد .روش های شناسایی مبتنی بر اسید های نوکلئیک ابزار های نوید بخشی هستند.در این میان روش های مبتنی بر تکثیریک قطعه ازDNAاز جایگاه ویژه ای برخوردار است(۲، ۴، ۱۱، ۱۳).
۲-۸٫ آنتی ژن های سطحی:
ترکیب آنتی ژنیک بروسلا بر حسب مرحله رشد باکتری متغیر می باشد . ساختار فسفولیپید آمینو هیدروکسی فرمیله شده شاخص آنتی ژنیک و مسئول آگلوتیناسیون سویه ها صاف بروسلا با آنتی سرم تهیه شده از کشت های صاف بروسلا است. این ترکیب در ارتباط کامل باLPSبوده و در آبورتوس تحت عنوان A و در بروسلا ملی تنسیس به نام Mخوانده می شود.اپی توپ های اختصاصی A و M به مقدار ناچیز در هر دو گونه دیده می شود.سویه های خشن بروسلا شباهت زیادی به سویه های صاف دارند هر دوحاوی لیپید A یکسان بوده که به واسطه دو کتو داکسی اکتو لوزوئیک اسید به بخش مرکزی پلی ساکاریدیLPSمتصل می باشد.ولیLPS سویه های خشن فاقد ترادف انتهایی متصل به بخش مرکزی است.LPS با فعالیت آندوتوکسینی ولی متمایزبا آندوتوکسین باکتری های روده ای است به طوریکه دارای اثرات سمیت کمتری برای خرگوش،جنین جوجه و موش های حساس به آندوتوکسین دارد.لیپید A به پلی میکسینB متصل نمی گردد،بنابراین اثر میتوژنیکی و فعالیت سمی آن حذف نمی شود. LPS بروسلا دارای خاصیت ادجوانتی نیز می باشد،چنانچه باعث تحریک تولید IgG3 و IgM به میزان بالایی می گردد.در واقع LPS بروسلا آنتی ژن اصلی حفاطت کننده موش و سایر حیوانات از جمله گاو در برابر بروسلوزیس است. LPSسویه های صاف بروسلا و زنجیره پلی ساکاریدی انتهایی آن تنها ساختاری است که بالاترین عرضه سطح سلولی را به خود اختصاص داده اند.(۶، ۲۸، ۳۱، ۳۲)
۲-۸-۱٫ لیپوپلی ساکارید(LPS ):
LPS از سه قسمت تشکیل شده است.داخلی ترین قسمت تحت عنوان لیپید A از فسفولیپید های غشاء خارجی شناور است.روی لیپید A بخش مرکزی قرارگرفته است که لیپید A را به قسمت سوم متصل میکند.خارجی ترین قسمت LPS زنجیره جانبی یا O-chain قرار گرفته که ترکیب قندی دارد.
LPS دارای دو فعالیت بیولوژیکی بسیار شاخص است:۱) خاصیت سمی(لیپید A)، ۲)خاصیت آنتی ژنیک (زنجیره جانبی)
۱)لیپید A از دی ساکارید فسفریله وبه طور شاخص از گلوکز آمین فسفوریله تشکیل شده است. لیپید A علاوه بر پایه ی قندی دارای زنجیره های اسید چرب متفاوتی است که به ساختار های قندی متصل اند.مهم ترین اسید های چرب :۱ اسید چرب غیر اشباع ۱۴ کربنه تحت عنوان Bهیدروکسی مرستیک اسید است.خاصییت سمی بودن لیپید A مربوط به این اسید چرب است. لیپید A به واسطه حضور اسید های چرب ساختار غیر قطبی دارد و در فسفولیپید غشاء خارجی فرو میرود
۲) بخش مرکزی یا core از ۵-۶ قند ۶یا ۷ کربنه تشکیل شده که بارها تکرار شده اند.قسمت مرکزی لیپید A به زنجیره جانبی متصل میکند.قسمت اصلی core مربوط به قند ۸ کربنه تحت عنوان KDO است یا کتو داکسی اکتا نوئیک اسید است که از مسیر بیوسنتزی پنتوز فسفات بدست می آید.در LPS حداکثر سه KDO عضور دارند.باکتری که نتواند KDO بسازد ( مانند باکتروئید زفراژیلیس ، فراوان ترین باکتری ساکن روده بزرگ انسان، بی هوازی اجباری ) LPS سستی ایجاد می کند.
۳) زنجیره جانبی از قند های ۶ کربنه تشکیل شده که تا ۲۵ بار می تواند تکرار شود.حدود ۵ تا ۶ نوع قند ۶ کربنه در ساختار مونومر زنجیره O شرکت می کند. دارای خاصیت آنتی ژنیک است که تحت عنوان Ag-O یاسوماتیک در گرم منفی ها شناخته میشود.زنجیره جانبی دارای وظایف متعدد در LPS است:۱ خاصیت آنتی ژنی ۲ فرار از مکانیزم سیستم ایمنی ۳ اتصال ۴ پذیرنده فاژ.برخی از انواع باکتری ها مثل انتروباکتریاسه، سالمونلا، توانایی تغییر زنجیره جانبی خود را دارند( توسط سیستم ایمنی شناسایی نمی شوند). آنتی ژن O به همراه پیلی از مهم ترین ادهسین ها باکتری گرم منفی اند که به آنها فاکتور های کلنی از گفته می شود.(۱۷)
۲-۸-۲٫ پروتئین غشاء خارجی(OMP):
پورفایل SDS-PAGE,Omp شامل همه سه استرین B.abortus در پلیت های یک تا سه است.۸باند سارکئسی ۱،این باند ها شامل پروتئین های یا وزن مولکولی ۸۹٫۰,۷۳٫۰,۵۳٫۷,۴۹٫۰,۳۸٫۰,۲۷٫۰,۲۲٫۳ و ۱۷٫۷ کیلو دالتون است(پلیت ۱).در میان این هشت باند ۲ باند پروتئین ۲۷٫۰ و ۵۳٫۷ رنگ پذیری کمی دارند.بروسلا RB51 دارای ۱۱ باند پروتئینی با وزن مولکولی بالا،متوسط و پایین می باشد.پروتئین ها با وزن مولکولی زیاد ۱۰۷٫۱ و ۷۴٫۱،وزن مولکولی متوسط ۵۳٫۷,۳۷٫۱,۳۴٫۲, و ۲۵٫۷، با وزن مولکولی کم ۲۱٫۸,۲۰٫۴,۱۸٫۱,۱۵٫۸ و ۱۲٫۵ کیلودالتون می باشند(پلیت۲).سه باند پروتئنی ۱۰۷٫۱,۲۱٫۸ و ۱۸٫۱ کیلودالتونی به نظر بیشترین غلظت رو به دیگر پروتئین ها دارند،نسبتا رنگ پذیری بالایی دارند.
بروسلا آبورتوس ۸ پروتئین ۱۵۱٫۱,۸۹٫۰,۷۵٫۸,۶۷٫۶,۳۷٫۰,۲۷٫۰,۲۴٫۰ و ۱۹٫۰ کیلو دالتون دارد (پیلت ۳).باند های پروتئینی ۷۵٫۸ و ۶۷٫۶ و ۱۹٫۰ رنگ پذیری کمی دارند.در حالیکه باند های ۳۷٫۰,۲۷٫۰ و ۲۴٫۰ دارای رنگ پذیری زیادی هستند.(Omp sodium lauryl sarcosinat)
Omp یک آنتی ژن حفاظت شده وبراساس وزن مولکولی به ۳ دسته طبقه بندی می شوند:۱)۸۸ تا ۹۴ کیلو دالتون، ۲)۳۶ تا ۳۸ کیلو دالتون(به عنوان پورین) ،۳) ۲۵ تا ۲۷ و ۳۱ تا ۳۶ کیلو دالتون
Omp ها جزساختار باکتری هستند ،به عنوان فاکتور بیماری زا عمل کرده و پاسخ ایمنی را القاء می کند. به دلیل اینکه بروسلا فاقد پیلی، فلاژل و کپسول است بیشترین میزان پاسخ ایمنی علیه ترکیبات ساختاری دیواره آن (ازجمله omp) ایجاد میشود.جون باکتری درون سلولی است احتمالا ایمنی سلولی نقش اصلی را بر عهده دارد،برای پاسخ موثر و حفاظت بخش.
در غشاء خارجی همه سویه های بروسلا ۲ نوع پروتئین ماژور و چندین پروتئین مینور دیده میشود.این پروتئین ها در الکتروفورز پلی آکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات نام گذاری شده اند . omp بیشتر در سطح باکتری های بروسلا بوویس وکانیس راف ظاهر میشود و درگیری آنها در بیماری زایی این سویه های خشن بروسلا از سویه های راف بروسلا محتمل تر می باشد.
حدود ۵۰% از وزن غشاء خارجی از پروتئین است یا در غشاء داخلی پروتئین و لیپوپروتئین ها به وسیله N –ترمینال متصل به لیپید به غشاء لنگر انداختن.بیش از یک دوجین از لیپوپروتئین های غشاء خارجی E.coli شناسایی شده اند.( Blattner et al., 1997).تعدادی از پروتئین های اینتگرال غشائی مانند:OMP A و پورین های عمومی دارای بیان زیادی هستند.علاوه بر این پروتئین هایی هستند که در زمان مورد نیاز سنتز میشوند مانند:پورین ها
پروتئین omp A در حدود ۱۰۰٫۰۰۰ کپی سلولی رخ می دهد که یکی از آن omp ماژور E.coliرا میسازد.نقشی ساختاری در تمامیت سطح سلول باکتری ایفا می کند.این پروتئین از ۲ دومین تشکیل شده:دومین N-terminal که در غشاء جاسازی شده با ۱۷۰ اسید آمینه،به عنوان یک لنگر غشایی است و دومین C-terminal با ۱۵۵ اسید آمینه .که در فضای پیریپلاسمیک طراحی شده تا با لایه ی پپتیدوگلیکان تعامل اختصاصی برقرار کند.(Demot and Venderleyden,1994;Koebnik,1995).احتمالا فعالیت های فیزیولوژی پروتئین omp A یک ارتباط فیزیولوژی بین غشاء خارجی و لایه ی پپتیدوگلیکان فراهم می کند.فرضیه ای که ثابت شده به وسیله مشاهدات اینکه ۲جهش در omp A و Lpp لیپوپروتئین رخ داده،omp ماژور دیگر که با پپتیدوگلیکان تداخل دارد سبب کروی شدن سلول میشود که فقط تحت شرایط اسمزی زنده می مانن (Sonntag et al., 1978
بعد از تلاش های زیاد برای حل ساختار omp A یا دومین های غشائی،جهش زایی site-directed پیش بینی بیان پروتئین های حلقه ای سطحی که کریستال های منظم ومرتب ومناسب برای کریستالوگرافی X-ray است.(Pautsch and Schulz,1998).این ساختار دارای یک توافق کامل با ساختار ۲بعدی مدل تاشو است، که،در حقیقت ،یکی از اولین پیشنهادات بود تنظیم ترنس ممبرن آنتی پارالل B-strands(Morona et al.,1984).در حالیکه مدل پیش بینی شده به طور صحیح محل ۸آنتی پارالل B-strands که متصل به ۳ ترن کوتاه پیریپلاسمی و۴ لوپ سطحی نسبتا بلند است،فقط اشعه ی X ساختار تنظیم شده زنجیره کناری درون بشکه ای را نشان داد.یک خوشه بسیار محافظت شده باقی مانده بار(lys-12,Glu-52,Arg-96.Arg-138 and Glu-140)،کشف شد،که ایجاد یک شبکه پل نمکی وباندهای هیدروژنی و برای توضیح omp A دارای پایداری حرارتی بالا است.با یک سطح پروتئین هیدرفوب و داخل قطبی،این دومین غشایی omp A میتوان یک مسیل معکوس انتظار داشت.(Pautsch and Schulz,1998).فضای هر بشکه دارای چند انطباق کوچک است ،شاید چاهک های پر از آب.این یافته در توافق خوبی با مطالعات اخیر جهش زایی تصادفی است،که در آن باقی مانده های داخلی پیدامیشوند که می توانند تغیرات تعداد زیادی سکانس را بدون مونتاژ ناخالص وناقص پروتئین فراهم کند،تحمل کند.که حجم زنجیره های جانبی بیش از حد بزرگ نشود.(Koebnik,1999a).)49)
۲-۸-۳٫ پورین های عمومی:
عموما منافذ از پورین ها شکل گرفته اند که اجازه عبور مولکول های هیدروفوبیک(کمتر از۶۰۰ کیلودالتون) میدهد وهیچ ویژگی خاصی نشان نمیدهد علی رقم برخی انتخاب ها برای آنیون وکاتیون.(۴۹)
۲-۹٫ واکسن های بروسلوز:
در مبارزه علیه بروسلوز، واکسیناسیون نقشی اساسی دارد. تاکنون واکسن های متعددی از سویه های زنده یا کشته ی بروسلا آبورتوس، بروسلاملی تنسیس و بروسلاسوئیس جهت ایمن سازی گاو، گوسفند و بز، خوک، شتر و دیگر حیوانات مورد استفاده قرارگرفته است، واکسیناسیون در انسان نیز به طور محدود انجام پذیرفته است.
مهمترین واکسن های مورد مصرف دامپزشکی را واکسن زنده ی سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس، واکسن زنده و کشته ی سویه ی ۲۰/۴۵ بروسلا آبورتوس، واکسن زنده ی سویه ی موکوئیدی M ۱۰۴ بروسلا آبورتوس، واکسن کشته ی سویه یH ۳۸ بروسلاملی تنسیس، واکسن زنده ی سویه ی Rev.۱ بروسلاملی تنسیس، واکسن زنده ی سویه یS۲ و غیره شامل می گشتند.
از فراکسیون های آنتی ژنی سویه های مختلف بروسلا نیز با موفقیت نه چندان چشمگیری استفاده شده است. از بین واکسن های فوق الذکر، واکسن تهیه شده از سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس(S.۱۹) و واکسن سویه ی Rev.۱ بروسلا ملی تنسیس از واکسن های انتخابی ایمن سازی علیه بروسلوز به ترتیب در گاو و گوسفند و بز بوده اند. سویه ی ۱۹ از شیر یک گاو نژاد جرسی در سال ۱۹۲۳ به وسیله ی BUCK جدا شده و حاد بود.
کشت باکتری به مدت یک سال به طور اتفاقی در دمای آزمایشگاه قرار گرفته و در تزریق به خوکچه ی هندی زهرآگینی خود را از دست داده، ضمن آنکه قابلیت ایمنی زایی آن حفظ شد. این باکتری نوزدهمین سری کشت ذخیره ی جدا شده به وسیله ی BUCK بوده و به همین جهت سویه ی ۱۹(Strain ۱۹) نام گرفت. در ۱۹۳۰، بوک نتایج موفقیت آمیز واکسن اصطلاحاً «باکتریون آبورتوس سویه ی ۱۹» را گزارش نمود. از آن زمان به بعد واکسن S.۱۹ به عنوان بهترین واکسن علیه بروسلوز گاوی شناخته شد و میلیارد ها دوز از آن در سطح جهان مصرف شده است.
حدود نیم قرن واکسن سویه ی ۱۹صرفاً درگوساله ها مصرف شده، لیکن از دهه ی ۱۹۸۰ با میزان جرم های متفاوت و به روش های تزریقی یا قطره ی چشمی در سنین مختلف گاوهای بالغ و آبستن نیز مورد استفاده بوده است. در ایران نیز واکسن سویه ی ۱۹ از اوایل دهه ی ۱۳۳۰ به طور وسیع در گوساله ها و از دهه ی ۱۳۷۰ به بعد به طور محدود در گاوهای بالغ مصرف شده است.