تصویر۴-۳) جنین ۲ سلولی(۲۰۰×)
تصویر ۵-۳) جنین در مراحل مختلف تقسیم(۴۰۰×).a : جنین در مرحله چهار سلولی، b : جنین در مرحله مورولا
c : جنین در مرحله بلاستوسیست، d : گامت های لقاح نیافته
تصویر ۶-۳) جنین­هایی با کیفیت عالی(۴۰۰×)
۴-۳) نتایج بخش هیستوشیمیایی
در تحقیق حاضر در گروه کنترل ساختار بافتی بیضه، مجاری منی­ساز و اپی­تلیوم زایای آن کاملاً منظم و طبیعی بود و تغییرات آتروفیک و دژنراتیو چندانی مشاهده نگردید. در گروه سیکلوسپورین­آ ساختار بافتی و سلولی بیضه دچار بی نظمی و تغییرات دژنراتیو گسترده شده بود و تغییراتی شامل آتروفی و بهم ریختگی مجاری منی­ساز، بی­نظمی در غشاء پایه مجاری همراه با جدا شدگی سلول­های اسپرماتوگونی از آن قابل مشاهده بود . هم چنین در اپی­تلیوم منی­ساز با وجود ظاهر مطبق، طبقات سلولی دارای آرایشی نامنظم بوده و در بعضی از مجاری توده­های هیالینی حاوی هسته­های متعدد و کوچک در لومن قابل مشاهده بود. سلول های سرتولی نیز در اپی­تلیوم زایا به تعداد کم تر و اکثراً با موقعیت قاعده­ای و نزدیک غشاء پایه قابل تشخیص بودند. گاهی مجاری منی­ساز در حیوانات تحت درمان با سیکلوسپورین­آ فاقد لومن مرکزی بودند که احتمالاً به دلیل غیر فعال شدن سلول­های سرتولی می­ باشد. بافت هم بند بینابینی بیضه در گروه تحت درمان با سیکلوسپورین­آ تقریباً همانند گروه ­های دیگر حاوی تمام اجزاء و سلول­ها بود ولی از تراکم و یک نواختی آن­ها کاسته شده و حالت فیبروز و ادم قابل مشاهده بود. کپسول بیضه (تونیکا آلبوژینه آ) در این گروه ظاهری شبیه گروه ­های کنترل داشته ولی افزایشی در تراکم رشت­ های کلاژن نسبت به سلول­ها قابل مشاهده بود. بافت بیضه حیوانات گروه ­های دریافت­کننده عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک از لحاظ ساختار هیستومورفولوژیکی تا حدود زیادی شبیه گروه ­های کنترل بود. بررسی­های بافت­شناسی بیضه حیوانات در گروه تحت درمان با سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و سیکلوسپورین + عصاره زالزالک نشان داد که اکثر تغییرات تخریبی و بی­نظمی­های ایجاد شده توسط داروی سیکلوسپورین­آ با تجویز عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک برگشت و تعدیل یافته بود. به طوری که مجاری منی­ساز نمایی طبیعی داشته و اپی تلیوم زایا نیز تا حدود زیادی سازمان یافتگی و حالت مطبق خود را بازیافته بود و بهم ریختگی کاهش یافته بود. غشاء پایه نیز تقریباً به وضعیت طبیعی خود نزدیک شده بود. بافت هم بند بینابینی بیضه نیز در گروه تحت درمان با سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و سیکلوسپورین + عصاره زالزالک از لحاظ ساختار شبیه گروه ­های کنترل بوده و سلول­ها، رشته­ها و عروق خونی از یک تراکم و نظم نسبتاً طبیعی برخوردار بودند.
۱-۴-۳) نتایج مربوط به رنگ آمیزی PAS:
این رنگ آمیزی جهت مشخص نمودن ذخایر کربوهیدرات­ها در رده سلول­های اسپرماتوژنز صورت گرفته است، نتایج حاصله مشخص کرد که میزان ذخایر کربوهیدرات­ها در گروه ­های دریافت کننده سیکلوسپورین روزهای ۲۵ و ۴۵ در ردیف­های اولیه سلول­های اسپرم ساز کاهش یافته و این کاهش در روز ۴۵ بخصوص در لوله های اسپرم­ساز آسیب دیده و نزدیک به کپسول بیضه بسیار مشهود می­باشد. اما در گروه سیکلوسپورین ₊ هسته انگور یک افزایش در ذخایر کربوهیدرات در رده­های اولیه سلول­های اسپرماتوژنز (۳ الی ۴ ردیف اول رده اسپرماتوژنز) دیده می­ شود. همچنین در گروه دریافت­کننده عصاره زالزالک نیز ذخایر کربوهیدراتی افزایش در ردیف های اول رده اسپرماتوژنز را نشان می­ دهند اما مطالعات ما مشخص نمود که این افزایش در ذخایر کربوهیدراتی در گروه دریافت کننده عصاره هسته انگور بخصوص در روز ۴۵ افزایش چشم­گیری را نشان می­دهد. اما در این مطالعه مشخص گردید که در لوله­های اسپرماتوژنز در ۳ الی ۴ ردیف به بعد ذخایر کربوهیدراتی در گروه رت­های دریافت کننده سیکلوسپورین افزایش یافته و این ذخایر در گروه سیکلوسپورین+ عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور کاهش یافته است.

تصویر ۷–۳ ) رنگ آمیزی PAS : تصویرراست گروه سیکلوسپورین -عصاره هسته انگور روز ۴۵
تصویر وسط گروه کنترل، تصویرچپ گروه سیکلوسپورین روز ۴۵
۲-۴-۳) نتایج مربوط به رنگ آمیزی Sudan Black :
در بررسی­های ما مشخص شد که در گروه سیکلوسپورین روزهای ۲۵ و۴۵ در ردیف­های اول ذخایر چربی در سلول­های رده اسپرماتوژنز نسبت به نسبت به گروه کنترل بالا رفته است و این افزایش در روز ۴۵ بیشتر از روز ۲۵ می­باشد. بخصوص نتایج حاصله مشخص کرد که این افزایش در ذخایر چربی در لوله­های اسپرم ساز نزدیک به کپسول بیضه مشهودتر می­باشد. اما در گروه ­های سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و سیکلوسپورین + عصاره زالزالک میزان ذخایر چربی در ردیف­های اول نسبت به گروه سیکلوسپورین کاهش یافته و در ردیف­های بالاتر (اسپرماتوسیت اولیه به بعد) بالا رفته است. در گروه سیکلوسپورین+ عصاره هسته انگور افزایش ذخائر چربی در ردیف های بالاتر افزایش چشم­گیری داشته است. بنابراین نتایج هیستوشیمیایی نشان می­دهد که این دارو که به عنوان یک داروی تضعیف­کننده سیستم ایمنی است می ­تواند یک سری تغییرات متابولیکی در لوله­های اسپرم­ساز ایجاد نماید که عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور تا حدود زیادی اثر محافظتی در جلوگیری از تغییرات متابولیکی این لوله­های اسپرم­ساز دارد.

تصویر ۸ -۳) رنگ آمیزی Sudan black : تصویرراست گروه سیکلوسپورین - عصاره هسته انگور روز ۴۵
تصویر وسط گروه کنترل، تصویرچپ گروه سیکلوسپورین روز ۴۵
۳-۴-۳) بررسی آلکالین فسفاتاز بافتی:
این آنزیم در بافت­ها و سلول­های آسیب دیده تولید شده و افزایش پیدا می­ کند. در مطالعه ما مشخص گردید که میزان اندکی از این آنزیم در سلول­های رده اسپرماتوژنز در لوله­های سمینیفر گروه کنترل وجود دارد که در گروه سیکلوسپورین روز ۲۵ و ۴۵ افزایش چشمگیری در میزان آلکالین فسفاتاز بافتی در تمامی رده­های سلول­های اسپرماتوژنز دیده می­ شود اما یک کاهش جزئی در گروه ­های تحت درمان با عصاره­های زالزالک و عصاره هسته انگور دیده می­ شود اما این کاهش در حد گروه کنترل نیست و این نشان دهنده اثر محافظتی متوسطی از عصاره­های مذکور بوده ولی مطالعات بعدی و طولانی مدت در زمان های بیشتر از ۴۵ روز جهت بررسی دقیق این آنزیم در رده­های سلول­های اسپرماتوژنز لازم و ضروری است که آیا میزان آنزیم در طولانی مدت در گروه ­های تحت درمان با عصاره­های مذکور چه تغییراتی پیدا خواهد کرد.

شکل ۹ -۳) رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز : تصویرA گروه کنترل ، تصویر B گروه سیکلوسپورین- عصاره هسته انگور روز ۴۵ ، تصویرC گروه سیکلوسپورین روز ۴۵ ، تصویرD دو لوله اسپرم ساز TDI negativ
۵-۳) نتایج حاصل از هیستومورفومتری بیضه
۱-۵-۳) نتایج حاصل از اندازه گیری قطرلوله­های سمینیفر(STsD) و ضخامت اپی تلیوم لوله­های سمینیفر(GEH)
طبق نمودار­های (۱۶-۳) و(۱۷-۳) میانگین مقادیر قطر مجاری منی­ساز و ضخامت اپی­تلیوم مجاری منی­ساز در گروه سیکلوسپورین کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل پیدا کرده است (p<0.05). درمان با عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک تا حد زیادی از کاهش قطر لوله­های سمینیفر جلوگیری کرد اما در پایان روز ۴۵ هنوز بین گروه ­های دریافت کننده دریافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگورنسبت به گروه کنترل اختلاف آماری معنی­داری در سطح p<0.05 وجود داشت. همچنین ضخامت اپی­تلیوم در گروه ­های دریافت کننده عصاره هسته انگور در روز ۴۵ با گروه کنترل در سطح p<0.05 اختلاف آماری معنی­داری مشاهده نشد، اما بین گروه دریافت کننده عصاره زالزالک و کنترل همچنان اختلاف آماری معنی­دار وجود داشت.
نمودار۱۶-۳: مقایسه میانگین قطر لوله­های منی ساز در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
نمودار۱۷-۳: مقایسه میانگین ضخامت اپی­تلیوم مجاری منی­ساز در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
۲-۵-۳) نتایج حاصل از اندازه گیری تعداد سلول های لیدیگ بیضه(LCN)
طبق نمودار( ۱۸-۳) میانگین تعداد سلول های لیدیگ بیضه در گروه سیکلوسپورین­آ (روز های ۲۵و ۴۵) نسبت گروه کنترل کاهش معنی­داری در سطح p<0.05 پیدا می­ کند. در صورتی که در گروه ­های تحت درمان هم زمان با سیکلوسپورین­آ و عصاره هسته انگور از لحاظ آماری تفاوت معنی داری در پارامترهای فوق با گروه کنترل مشاهده نگردید(P>0.05). این پارامتر در گروه دریافت کننده عصاره زالزالک همراه با داروی سیکلوسپورین نسبت به گروه کنترل افزایش معنی­داری پیدا نکرده و از لحاظ آماری(p<0.05 ) بین آنها تفاوت معنی­دار وجود دارد.
نمودار۱۸-۳: مقایسه میانگین تعداد سلول­های لیدیگ در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
۳-۵-۳) نتایج حاصل از اندازه ­گیری تعداد سلول­های لنفاوی تک­هسته­ای
طبق نمودار (۱۹-۳) در گروه ­های تیمار شده با سیکلوسپورین­آ در روزهای ۲۵ و ۴۵ تعداد سلول­های لنفاوی تک هسته­ای نسبت به گروه کنترل در سطح p<0.05 کاهش می­یابد. با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته­انگور این پارامتر بهبود یافت طوری که در روزهای ۲۵ و ۴۵ بین گروه هایی که همراه با سیکلوسپورین عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را دریافت کردند با گروه کنترل اختلاف آماری معنی­داری مشاهده نشد(P>0.05).
نمودار۱۹-۳: مقایسه میانگین تعداد سلول­های لنفاوی تک­هسته­ای در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
۶-۳) نتایج حاصل از ارزیابی های اسپرماتوژنز در بافت بیضه
بررسی­های آماری جهت مقایسه شاخص­ های اسپرماتوژنز در گروه ­های مختلف آزمایشی آشکار ساخت که تجویز داروی سیکلوسپورین­آ منجر به حذف سلول­های زایا در روند اسپرماتوژنز می­گردد که این امر کاهش معنی­داری (p<0.05) را در ضریب تمایز لوله­ای، ضریب باز­سازی لوله­های منی­ساز، ضریب میوزی و ضریب سلول سرتولی در مقایسه با گروه کنترل در پی­دارد.
۱-۶-۳) نتایج حاصل ازاندازه گیری ضریب میوزی (MI) و ضریب بازسازی (RI)
طبق نمودارهای (۲۱-۳) و (۲۰-۳) ضریب میوزی و ضریب بازسازی در گروه ­های دریافت کننده سیکلوسپورین نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­داری را در سطح p<0.05 نشان می­ دهند. ضریب میوزی در گروه ­های دریافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور، تنها در روز ۴۵ هیچ گونه اختلاف آماری معنی­داری با کنترل نشان نداد(P>0.05). ضریب بازسازی در گروه­هایی که علاوه بر سیکلوسپورین­آ، عصاره زالزالک را دریافت کردند(روز ۴۵) نسبت به گروه ­های سیکلوسپورین­آ افزایش و در مقایسه با گروه کنترل دارای اختلاف آماری معنی­داری نبود (p<0.05) و در گروه­هایی که عصاره هسته انگور(روز ۴۵) دریافت کردند تاحدی بهبود یافت و دارای اختلاف آماری معنی­دار با گروه کنترل نمی­باشند(P>0.05).
نمودار۲۰-۳: مقایسه میانگین درصد ضریب بازسازی در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
نمودار۲۱-۳: مقایسه میانگین درصد ضریب میوزی در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
۲-۶-۳)نتایج حاصل ازاندازه گیری ضریب تمایز لوله­ای(TDI)
طبق نمودار(۲۲-۳) ضریب تمایز لوله­ای در گروه CsA (روزهای ۲۵و ۴۵) در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی­داری­ را در سطح p<0.05 نشان می­دهد. تجویز هم زمان عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک با سیکلوسپورین­آ از کاهش ضریب تمایز لوله­ای جلوگیری کرده و حتی به طور معنی داری باعث افزایش آن­ها در گروه ­های روز ۴۵ می­گردد (p<0.05).
­
نمودار۲۲-۳: مقایسه میانگین ضریب تمایز لوله­ای در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
۳-۶-۳) نتایج حاصل از اندازه گیری ضریب سلول­های سرتولی (SCI)
طبق نمودار(۲۳-۳) میانگین ضریب سلول­های سرتولی در گروه سیکلوسپورین­آ (روز های ۲۵و ۴۵) نسبت گروه کنترل کاهش معنی­داری را در سطح p<0.05 نشان می­دهد. درصورتی که این پارامتر در گروه ­های تحت درمان هم زمان با سیکلوسپورین­آ و عصاره هسته انگور نسبت به گروه دریافت کننده سیکلوسپورین­آ افزایش یافت و تفاوت معنی­داری از لحاظ آماری در سطح p<0.05 بین گروه ­های سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و با گروه کنترل مشاهده نشد (P>0.05) ولی این پارامتردر گروه دریافت کننده عصاره زالزالک همراه با داروی سیکلوسپورین نسبت به گروه کنترل افزایش معنی­داری در سطح p<0.05 پیدا نکرده و از لحاظ آماری بین آن­ها تفاوت معنی­دار مشاهده شد.
نمودار۲۳-۳: مقایسه ضریب سلول­های سرتولی در گروه ­های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنی­دار در سطح p<0.05 است.
فصل چهارم
بحث و نتیجه ­گیری
در این مطالعه اثر عصاره هسته انگور سیاه و عصاره زالزالک بر روی تغییرات هیستوشیمی بیضه، وتوان باروری (IVF) در موش رت نر که با داروی سانتیمون(سیکلوسپورین) درمان شده ­اند بررسی شد.
مواجه شدن اسپرم با مقادیر بالای ROS آسیب به DNA اسپرم را در پی دارد که این آسیب می ­تواند به صورت تغییر در ساختار بازهای DNA، ایجاد جایگاه های بدون باز در DNA، حذف و تغییر چارچوب باز­های DNA، ایجاد اتصال­های غیر طبیعی بین دو رشته DNA و بازآرایی­های کروموزومی نمود پیدا کند (Kemal Duru et al., 2000). افزایش میزان ROS همچنین می ­تواند موجب اشکال گوناگونی از جهش­های ژنی مانند جهش­های نقطه­ای و چند شکلی­های ژنتیکی گردد که به کاهش کیفیت اسپرم منجر خواهد شد ((Spiropoulos et al., 2002.در مطالعه حاضر نیز مشخص شد که درصد اسپرم­های با کروماتین آسیب دیده و اسپرم های نابالغ در گروه ­های تیمار شده با سیکلوسپورین آ نسبت به گروه کنترل افزایش معنی داری را در سطحP<0.05 نشان داد. اگر میزان آسیب به DNA اسپرم ناچیز باشد، خود اسپرم و یا حتی اووسیت قادر به ترمیم DNA آسیب دیده اسپرم خواهند بود (Agarwal et al., 2007). در صورت گسترده بودن آسیب­ها، آپوپتوز و قطعه قطعه شدن جنین امری محتمل خواهد بود. کاهش میزان باروری و کیفیت جنین با میزان فراوانی DNA های آسیب دیده ارتباط مستقیم دارد (Sakkas et al., 1998). اسپرم سلولی است که غشاء آن دارای مقادیر بالایی از اسیدهای چرب غیر اشباع می­باشد و اسپرم­ها در طی اسپرمیوژنز بخش عمده­ای از سیتوپلاسم خود را که حاوی آنتی­اکسیدانت­ها است از دست می­دهد بنابراین این سلول­ها نسبت به پراکسیداسیون چربی به وسیله O₂ و H₂O₂ حساسند (Storey, 1997). حضور اسیدهای چرب غیر­اشباع با زنجیره بلند در ساختار لیپیدی اسپرم نیاز به سیستم آنتی­اکسیدانتی کارآمد دارد تا در آسیب­های پراکسیداتیو که در ارتباط با اختلال در عملکرد اسپرم هست محافظت نماید ((Aitken, 1995.
اسپرم پستانداران به غیر از خرگوش ، که اسپرم آن دارای میزان بالایی کاتالاز است و اسپرم را در برابر H₂O₂ محافظت می­ کند در سایر گونه­ ها دارای میزان پایینی از کاتالاز است. در شرایط جفت­گیری طبیعی اسپرم در معرض شرایط بی­هوازی قرار گرفته و در نتیجه آسیب­های بالقوه رادیکال­های آزاد اکسیژن کاهش می­یابد. علاوه بر این مایعات اویداکت حاوی مقادیر بالایی از آنتی­اکسیدانت ها نظیر تائورین هست (۱۹۸۷ Miller & Shultz,) که یک مکانیسم محافظتی مهم در رادیکال­های آزاد اکسیژن می­باشد. ولی هنگامی که اسپرم برای برنامه IVF مورد استفاده قرار می­گیرد و یا در هنگام تلقیح مصنوعی حیوانات در طول پروسه، اسپرم در معرض اکسیژن و نور در سیستم هوازی قرار می­گیرد می ­تواند سبب تولید رادیکال­های