الکل ۱۰۰ درصدІ
۱دقیقه
الکل۱۰۰درصدІІ
۱دقیقه
شفاف سازی
گزیلولІ
۵دقیقه
گزیلولІІ
۵ دقیقه
جدول ۲-۱ مراحل رنگ آمیزی هماتوکسیلین ایوزین
۲-۶-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی
جهت ارزیابی مرگ سلولی از تکنیک فلوسایتومتری و رنگ فلورسنت [۴۱]PI با قابلیت اتصال به DNA تخریب شده و جهت ارزیابی آپوپتوز سلولی از کیت AnnexinV FITC/ PI [۴۲] استفاده شد (۳۳).
۲-۶-۱-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه
۲-۶-۱-۱-هضم مکانیکی
جهت هضم مکانیکی بافت بیضه، ابتدا قطعات بیضه توسط سرنگ انسولین تکه تکه شدند و سپس به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ (۱۵ RPM) شدند. نهایتا رسوبات حاصل به محیط هضم آنزیمی منتقل شد.
۲-۶-۱-۲-هضم آنزیمی
الف: تهیه ی محیط هضم آنزیمی
جهت تهیه محلول هضم آنزیمی، یک میلی گرم کلاژنازIV[43] و یک میکروگرم DNase1[44] در یک سی سی محلول DMEM حل شد.
ب: هضم آنزیمی
قطعات بافتی حاصل از هضم مکانیکی، در محیط هضم آنزیمی قرار داده شدند و به مدت ۲۰ دقیقه در انکوباتور قرار گرفتند. جهت تسهیل هضم آنزیمی، محلول هر ۵ دقیقه یکبار پیپتاژ شد (۳۳).
۲-۶-۱-۳-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با بهره گرفتن از رنگ PI
پس از اتمام زمان انکوباسیون، محلول حاصل از فیلتر دارای منافذ۴۰ میکرومتری[۴۵] عبور داده شد و با اضافه کردن محیط DMEM حاوی ۲۰% سرم FBS اثر آنزیم ها خنثی گردید. سپس محلول حاصل با دور ۲۰ RPM و به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ شد. به ازای هر یک میلیون سلول یک میکرولیتر رنگ PI (که با غلظت۲ میلی گرم در یک میلی لیتر PBS تهیه شده بود) به محلول اضافه شد و به مدت ۳-۲ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. در پایان ارزیابی بقای سلولی با بهره گرفتن از روش فلوسایتومتری انجام شد.
۲-۶-۲-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری
در این روش ابتدا سلولهایی که رنگ نگرفته بودند توسط دستگاه فلوسایتومتری شمارش شد و نمودار نقطه ای براساس [۴۶]SSC در محور عمودی و FSC[47] در محور افقی رسم گردید، تا مختصات سلول ها و وضعیت آنها مشخص گردد. سپس نمودار دوم براساس FSC در محور افقی و FL3[48] در محور عمودی رسم شد و محل جمعیت سلولهای زنده در این نمودار مشخص گردید. سپس سلولهای رنگ شده توسط دستگاه شمارش شدند و با تعیین محدوده ی سلولهای زنده در نمودار دوم، درصد بقا در نمودار سوم محاسبه شد و توسط نمودار ۴، درصد سلولهای زنده از لحاظ آماری مشخص گردید (شکل ۲-۱).
شکل۲-۱-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری
۲-۶-۳-بررسی آپوپتوز سلولی
وجود فسفاتیدیل سرین[۴۹] در سطح سلول از نشانه های وقوع آپوپتوز است. از آنجاییکه Annexin در حضور یون کلسیم تمایل زیادی به اتصال به فسفاتیدیل سرین دارد، بنابراین از آن در تشخیص آپوپتوز سلولی استفاده می شود (۳۳). برای بررسی آپوپتوز سه حجم ۱۰۵×۵-۱ سلول مورد نیاز است.
دو حجم از این سلولها با بهره گرفتن از بافر کلسیم[۵۰] ۱x شستشو داده شد و ۱۰۰ میکرولیتر بافر کلسیم ۱xو ۵ میکرولیتر AnnexinV FITC به سلول های هر حجم اضافه گردید و به مدت ۱۵ دقیقه انکوباسیون بر روی یخ و در شرایط تاریکی انجام گرفت.
پس از اتمام زمان انکوباسیون، سوسپانسیون سلولی با اضافه کردن PBS و سانتریفوژ (۱۵ RPM به مدت ۵ دقیقه) شستشو داده شد و در نهایت ۱۰۰ میکرولیتر PBS و ۳ میکرولیتر رنگ PI به رسوب سلولی اضافه شد.
مطابق با ارزیابی بقای سلولی، در این تست نیز ابتدا نمونه ی سلولی بدون رنگ توسط دستگاه شمارش شد و نمودار FSC vs SSC و [۵۱] FL1[52] vs FL2 رسم شد تا جمعیت سلولی در محل صحیح قرار گیرد، سپس نمونه ی حاوی AnnexinV FITC برای اصلاح هم پوشانی رنگ های فلورسنت توسط دستگاه شمارش شد و در انتها نمونه ی حاوی هر دو رنگ در دستگاه شمارش شدند. آنچه به دست آمد جمعیت های مختلف سلولی بودند که در موقعیت های خاص خود قرار داشتند.
CA
B
A
D
شکل۲- ارزیابی وقوع آپوپتوز
A: جمعیت سلول های زنده
B: جمعیت سلولی که دچار آپوپتوز اولیه شده اند
C: جمعیت سلولی که دچار نکروز شده اند
D: جمعیت سلولی که دچار آپوپتوز ثانویه هستند
