مناطق نمونه برداری شده تعداد کل نمونهها تعداد نمونههای آلوده درصد آلودگی
گالیکش ۲۴ ۷ ۲۹.۱
مینودشت ۱۲ ۵ ۴۱.۶
آزادشهر ۴۰ ۱۱ ۲۷.۵
گرگان ۳۳ ۱۵ ۴۵.۴۵
علی آباد ۳۰ ۱۵ ۵۰
کردکوی ۳۱ ۱۷ ۵۴.۸
همان گونه که از جدول ۴-۱ بدست می آید منطقه کردکوی با ۵۴.۸ درصد فراوانی آلودگی بیشترین میزان آلودگی را به PVY در بین مناطق دیگر در سال زراعی ۹۱ نشان داد. مناطق علی آباد، گرگان، مینودشت، گالیکش از نظر فراوانی آلودگی به ویروس Y سیب زمینی در رتبه های بعدی قرار گرفتند.
شکل ۴-۴ نتایج تست سرولوژیک نمونه های آلوده به pvy درسطح مناطق مختلف استان
۴-۳ مطالعات گلخانه ای
ظهور علائم به صورت نقاط کلروتیک و روشن پراکنده در سطح برگهای تازه تشکیل شده بود که به تدریج به موزائیک، نکروز رگبرگ، پیسک، روشنی رگبرگ، پیچش حاشیه برگ و در نهایت در برخی میزبانها نکروز شدید را به همراه داشت. مرگ سلولهای آبکشی و عدم انتقال شیره پرورده و مواد غذایی به سلولهای پارانشیم برگ باعث ضعف گیاه شده و در نتیجه مقاومت گیاه را به شدت کاهش داده و همین امر منجر به مرگ برخی گیاهان شد.
علائم ایجاد شده بر روی گیاه N. samsun علاوه بر علائم فوق حالت نکروز رگبرگی و موزائیک بود که در نهایت منجر به لکههای نکروتیک شد (اشکال ۴-۴ تا۴-۱۰). هرچند برخی ایجاد آلودگی برروی گیاه نکردند یا علائم بسیار خفیف بود. شاید دلیل این امر را واکنش گیاه، نوع نژاد ویروس یا پایین بودن غلظت ویروس در گیاه دانست.
شکل ۴-۵- نکروز و موزائیک برروی گیاه توتون رقم سامسون بوسیله تلقیح PVY
شکل ۴-۶- ایجاد موزائیک و بوسیله ویروس Y سیب زمینی
شکل ۴-۷- ایجاد نکروز رگبرگ بوسیله PVY
۴-۵- نتایج آزمون RT-PCR
پس از تعیین ترادفهای بدست آمده در تکثیر توسط آغازگرهای اختصاصی ترادفها با اطلاعات موجود در GenBank در پایگاه اطلاعاتی NCBI و برنامه BLAST مقایسه شدند و صحت ویروسی بودن قطعات و شباهت آنها به ترادفهای PVY موجود در GenBank تایید شد.
استفاده از آغازگرهای اختصاصی PVY باعث تکثیر قطعاتی با اندازه۹۹۰ نوکلئوتیدی از ناحیه CP شدند (شکل ۴-۱۲).
شکل ۴-۸- نتایج آزمون PCR در ژل آگارز ۱% با بافر TBE. سمت چپ: مارکر DNA. چاهک آلوده به PVY. قطعه ای به اندازه ۹۹۰ نوکلئوتید تکثیر شده است.
این ترادفها با ترادف سایر جدایههای PVY موجود در بانک ژن توسط برنامه Clustal X همردیف و مقایسه شد و مشابهت نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی بین آنها در برنامه MegAlign محاسبه شد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از همردیف سازی ترادفها توسط برنامه MEGA5 به روش Neighbor-joining با متد Kimura-2 بدست آمد و به وسیله نرم افزار Treeview نیز مشاهده شد (Kumar et al. 2004). در این تجزیهها ویروس موزاییک موزاییک کوتولگی ذرت (maize dwarf mosaic virus,MDMV) به عنوان Outgroup استفاده شد.
برای مقایسه جدایههایPVY ایران با یکدیگر و با سایر جدایههای دنیا از ترادف نوکلئوتیدی ژن CP استفاده گردید. ابتدا آنالیز ژن CP موجود از جدایه های PVY بر حسب کشور منشاء بطور جداگانه صورت گرفت و از بین جدایههای با مشابهت بالا تعدادی انتخاب شد (NCBI) و در نهایت برای ۵۰ جدایه از PVY ایران به همراه تعدادی از جدایه های سایر نقاط دنیا درخت فیلوژنتیکی بدست آمده و تجزیه شد.
شکل۴-۹- دندروگرام (درختواره) حاصل از گروهبندی ایزولههای توالییابی شده در این آزمایش به همراه ایزولهها و استرینهای ایرانی موجود در بانک ژن که به روش Parsimony Maximum-در نرم افزار MEGA5 به دست آمده است.
