میزان فنل­کل در عصاره­های برگ با روش Folin-Ciocalteu و با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه ­گیری شد. بدین منظور، ابتدا 1/0 گرم اسید­گالیک با متانول به حجم 100 میلی­لیتر رسانده شد، سپس محلول 10 درصد فولین (5 میلی­لیتر فولین با آب­مقطر به حجم 50 رسانده شد) و کربنات سدیم 5/7 درصد (5/7 گرم کربنات سدیم در 100 سی­سی آب حل شد) تهیه شد. محلول به دست آمده به مدت 5/1 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری شد و بعد از آن میزان جذب با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر اندازه ­گیری گردید [Singleton et al., 1999].
براي تهیه محلول­های استاندارد، مقدار 1/0 گرم گالیک اسید با متانول خالص به حجم 100 میلی­لیتر رسانده شد. سپس از این محلول استاندارد به ترتیب مقادیر حجمی 5، 10، 20، 30، 40، 50، 60، 70، 80، 90، 100 و 120 میکرولیتر برداشته و داخل لوله آزمایش شیشه ­ای ریخته شد. به هر کدام از آن­ها مقدار 2500 میکرولیتر فولین رقیق شده با آب مقطر افزوده شد. پس از 10 تا 15 دقیقه، 2000 میکرولیتر کربنات سدیم اضافه گرديد. میزان جذب محلول­های استاندارد پس از 5/1ساعت قرائت گرديد. سپس منحنی استاندارد از روي الگوي جذب ترسيم شد. ميزان فنل كل از روي میزان جذب نمونه و مقایسه آن با منحنی استاندارد (شکل 2-1)، بر حسب ميلي­گرم گاليك اسيد در یک گرم ماده تر گیاهی بيان شد.
شکل 2-1- منحنی و معادله استاندارد فنل کل بر حسب گالیک اسید
2-6-8- ظرفیت آنتی­اکسیدانی کل
ظرفیت آنتی­اکسیدانی عصاره­ها، از طریق خنثی­کنندگی رادیکال آزاد DPPH (2و2 دی­فنیل1-پیکریل هیدرازیل) تعیین شد. برای این منظور با بهره گرفتن از سمپلر، مقدار 50 میکرولیتر از عصاره­ها داخل لوله­های فالکون کوچک ریخته شد و 950 میکرولیتر محلول DPPH 1/0 میلی نرمال به آن­ها اضافه شد. محلول حاصل به سرعت به هم زده شده و سپس به مدت 30 دقیقه در یک محفظه تاریک در دمای اتاق نگهداری شد. نمونه بلنک (صفر) و استاندارد به ترتیب شامل 1 میلی­لیتر حلال استخراج و 1 میلی­لیتر محلول 1/0 نرمال DPPH بود. سپس میزان جذب استاندارد و نمونه با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، در طول موج 517 نانومتر تعیین شد. ظرفیت آنتی­اکسیدانی عصاره­ها به صورت درصد بازدارندگی DPPH با بهره گرفتن از رابطه زیر محاسبه شد (2-8)، [Singleton et al., 1999].

Antioxidant activity (DPPHSce%) = (A_cont – A_samp)/A_cont × 100 (2-8)
که در آن:
=%DPPH_sc درصد بازدارندگی رادیکال
DPPH A_cont = میزان جذب DPPH
A_samp= میزان جذب (نمونه + DPPH)
2-7-ارزیابی صفات بیوشیمیایی
2-7-1-کربوهیدرات­های محلول
نمونه­های گیاهی تهیه شده، به مدت 48 ساعت درون آون در دمای 75 درجه سانتیگراد خشک و بعد آسیاب شدند و سپس با غربال مش شماره 8، الک شدند. 03/0 گرم از پودرهای تهیه شده درون تیوب­های 15 میلی­لیتری ریخته شدند. سپس10 میلی­لیتر اتانول80% کاملاً داغ به تیوب­ها اضافه و به مدت 30 ثانیه ورتکس شدند و به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. بخش روشناور نمونه­ها به تیوب­های 50 میلی­لیتری منتقل شدند و مراحل اضافه نمودن 10 میلی­لیتر اتانول 80% داغ به رسوب انتهایی، ورتکس، سانتریفیوژ و اضافه نمودن روشناور به تیوب 50 میلی­لیتر جدید دیگر، دوبار تکرار شد تا تمامی قندهای محلول موجود در نمونه گیاهی استخراج گردند. در مرحله بعد، تیوب­ها به مدت 24 ساعت درون آون با دمای 60 درجه سانتیگراد قرار داده شدند تا اتانول موجود در آن­ها کاملا تبخیر گردد. پس از تبخیر کامل اتانول، مقدار 40 میلی­لیتر آب مقطر به تیوب­ها اضافه و به مدت 2 دقیقه ورتکس شدند. به منظور حذف رسوبات اضافی و دیگر ترکیبات زائد، مقدار 5 میلی­لیتر سولفات روی 5% و 7/4 میلی­لیتر هیدروکسید باریوم 3/0 نرمال به تیوب­ها اضافه و مجددا ورتکس شدند. سپس تیوب­ها با سرعت 3000 دور در دقیقه در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. همزمان 1 میلی­لیتر از روشناورها و 1 میلی­لیتر از محلول­های استاندارد گلوکز (0، 10، 20، 40، 60، 80، 100 و 200 قسمت در میلیون) به تیوب 15 میلی­لیتر جدید انتقال داده شدند و به هریک از آن­ها 5/0 میلی­لیتر محلول فنل 5% اضافه و به شدت تکان داده شدند تا حباب­های کف سفید رنگ، داخل تیوب­ها نمایان شوند. مقدار 5/2 میلی­لیتر اسید سولفوریک 98% بوسیله سرنگ (دیسپنسر^[42]) به داخل تیوب­ها با فشار اضافه شد. پس از گذشت 45 دقیقه تا یک ساعت با تثبیت رنگ، توأم با خنک شدن تیوب­ها، ميزان جذب نمونه­ها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه­گيری شد. در نهایت محتوای قند­های محلول، از روي میزان جذب نمونه­ها و مقایسه آن با منحنی استاندارد (شکل 2-2)، و با توجه به رابطه زیر (2-9)، بر حسب میلی­گرم در گرم وزن خشک بيان شد [Kochert, 1987]
(2-9)
که در آن:
E : مقدار قند نمونه بر حسب میلی­گرم در گرم وزن خشک
C : غلظت نمونه بر حسب میلی­گرم در لیتر
D : درجه رقت
V : حجم نهایی عصاره تهیه شده
DM : وزن ماده خشک بر حسب گرم
شکل 2-2- منحنی و معادله استاندارد گلوکز
2-7-2-کربوهیدرات­های نامحلول
نمونه­های گیاهی تهیه شده، به مدت 48 ساعت درون آون در دمای 75 درجه سانتیگراد خشک و بعد آسیاب شدند و سپس با غربال مش شماره 8، الک شدند. 03/0 گرم از پودرهای تهیه شده درون تیوب­های 15 میلی­لیتری ریخته شدند. سپس10 میلی­لیتر اتانول80% کاملاً داغ به تیوب­ها اضافه و به مدت 30 ثانیه ورتکس شدند و به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. بخش روشناور نمونه­ها به تیوب­های 50 میلی­لیتری منتقل شدند و مراحل اضافه نمودن 10 میلی­لیتر اتانول 80% داغ به رسوب انتهایی، ورتکس، سانتریفیوژ و اضافه نمودن روشناور به تیوب 50 میلی­لیتر جدید دیگر، دوبار تکرار شد تا تمامی قندهای محلول موجود در نمونه گیاهی استخراج گردند. تفاله­های حاصل بعد از عمل شست و شو با اتانول جمع آوری و به مدت 2 ساعت درون دستگاه آون در دمای 50 درجه سانتیگراد خشک شدند. 5/4 میلی­لیتر آب مقطر و 6 میلی­لیتر پرکلریک اسید 52% به نمونه­ها اضافه شدند و به مدت 24 ساعت درون یخچال در دمای 4 درجه سانتی ­گراد قرار داده شدند. سپس، به منظور جداسازی فاز رویی محلول، نمونه­ها در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. روشناورهای به دست آمده، درون فالکون 50 میلی­لیتری جدید ریخته شدند و 30 میلی­لیتر آب مقطر به آن­ها اضافه شد.
همزمان 1 میلی­لیتر از روشناورها و 1 میلی­لیتر از محلول­های استاندارد گلوکز (0، 10، 20، 40، 60، 80، 100 و 200 قسمت در میلیون) به تیوب 15 میلی­لیتر جدید انتقال داده شدند و به هریک از آن­ها 5/0 میلی­لیتر محلول فنل 5% اضافه شد و به شدت تکان داده شدند تا حباب­های کف سفید داخل تیوب­ها نمایان شوند. مقدار 5/2 میلی­لیتر اسید سولفوریک 98% بوسیله سرنگ (دیسپنسر) به داخل تیوب­ها با فشار اضافه شد. پس از گذشت 45 دقیقه تا یک ساعت با تثبیت رنگ، توأم با خنک شدن تیوب­ها، ميزان جذب نمونه­ها در طول موج 485 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه­گيری شد. در نهایت محتوای قند­های نامحلول، از روي میزان جذب نمونه­ها و مقایسه آن با منحنی استاندارد (شکل 2-2)، و با توجه به رابطه زیر (2-10)، بر حسب بر حسب میلی­گرم در گرم وزن خشک بيان شد [Kochert, 1987]
(2-10)
که در آن:
E : مقدار قند نمونه بر حسب میلی­گرم در گرم وزن خشک
C : غلظت نمونه بر حسب میلی­گرم در لیتر
D : درجه رقت
V : حجم نهایی عصاره تهیه شده
DM : وزن ماده خشک بر حسب گرم
2-7-3-پرولین
5/0 گرم ماده تر گياهي از برگ­های شاخه اصلی (برگ­های توسعه یافته از گره­های 4 و 5) در پایان آزمایش با هاون له و درون تيوب­های 15 ميلي­ليتري ريخته شدند. سپس 10 ميلي­ليتر اسيد سولفوساليسيليک 3 درصد به آن­ها اضافه شد و به مدت 10 دقیقه درون حمام آب يخ قرار داده شدند. تيوب‌ها با سرعت 15000 دور در دقيقه به مدت 10 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد سانتريفيوژ شدند تا مواد اضافي از محلول جدا شوند. 2 ميلي­ليتر از روشناور حاصل از سانتريفيوژ، درون تيوب­های 15 ميلي­ليتری جديد ريخته شدند و 2 ميلي­ليتر اسيد نين­هيدرين و 2 ميلي­ليتر اسيد استيک خالص به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شدند. همزمان مقدار 2 ميلي­ليتر از استانداردهاي 0، 4، 8، 12، 16 و 20 ميلي­گرم در ليتر پرولين درون تيوب­هاي جديد ريخته و 2 ميلي­ليتر اسيد نين­هيدرين و 2 ميلي­ليتر اسيد استيک گلاسيال به آن افزوده و سپس خوب مخلوط شدند. نمونه­هاي اصلي و استاندارد ابتدا به مدت يک ساعت درون حمام آب گرم در دماي 100 درجه سانتي گراد و سپس به مدت 10 دقیقه درون حمام آب يخ قرار داده شدند تا کاملاً سرد شده و واکنش متوقف شود. سپس 4 ميلي­ليتر تولوئن به محلول اضافه شد و به مدت 20 ثانيه با دستگاه ورتکس هم زده شدند. ميزان جذب نمونه­ها در طول موج 528 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه­گيری شدند. در نهایت محتوای پرولین، از روي میزان جذب نمونه­ها و مقایسه آن با منحنی استاندارد و با توجه به رابطه (2-11)، بر حسب ميکرومول در گرم نمونه تر گیاهی بيان شد .
(2-11)
شکل 2-3- منحنی و معادله استاندارد پرولین
2-7-4- پراکسیداسیون لیپیدها
براي سنجش مقدار پراكسيداسيون ليپيد­هاي غشاء، غلظت مالون­دی­آلدئيد و ساير آلدئيد­ها كه محصولات اكسيداسيون اسيد­هاي چرب غير­اشباع هستند، اندازه­گيري شد.
2-7-4-1- مالون دی­آلدئيد (MDA)
2/0 گرم از بافت تازه برگي از برگ­های شاخه اصلی (برگ­های توسعه یافته از گره­های 4 و 5) در پایان آزمایش در هاون چيني حاوي 5 ميلي­ليتر تري­كلرواستيك اسيد 1/0 درصد سائيده شد. عصاره حاصل با بهره گرفتن از دستگاه سانتريفوژ به مدت 5 دقيقه در 10000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. به يك ميلي­ليتر از محلول رويي حاصل از سانتريفوژ، 5 ميلي­ليتر محلول تري­كلرواستيك اسيد 20 درصد كه حاوي 5/0 درصد اسيد تيو­باربيتوريك بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقيقه در دماي Cº95 حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام يخ سرد گرديد و مجددأ به مدت 10 دقيقه در 10000دور در دقیقه سانتريفوژ شد. ميزان جذب نمونه­ها در طول موج 532 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه­گيری شدند. ماده مورد نظر براي جذب در اين طول موج كمپلكس قرمز رنگ MDA-TBA است. جذب سایر رنگيزه­هاي غير­اختصاصي در 600 نانو­متر تعيين و از اين مقدار كسر شد. براي محاسبه غلظت مالون­دی­آلدئيد از ضريب خاموشي معادل mM^-1cm^-1 155 استفاده شد و نتايج حاصل از اندازه­گيري بر حسب نانو­مول بر گرم وزن­‌تر محاسبه شد .
2-7-4-2-سنجش ساير آلدئيد­ها (پروپانال، بوتانال، هگزانال، هپتانال و پروپانال دي متيل استال)
2/0 گرم از بافت تازه برگي از برگ­های شاخه اصلی (برگ­های توسعه یافته از گره­های 4 و 5) در پایان آزمایش در هاون چيني حاوي 5 ميلي­ليتر تري­كلرواستيك اسيد 1/0 درصد سائيده شد. عصاره حاصل با بهره گرفتن از دستگاه سانتريفوژ به مدت 5 دقيقه در 10000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. به يك ميلي­ليتر از محلول رويي حاصل از سانتريفوژ، 5 ميلي­ليتر محلول تري­كلرواستيك اسيد 20 درصد كه حاوي 5/0 درصد اسيد تيو­باربيتوريك بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقيقه در دماي Cº95 حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام يخ سرد گرديد و مجددأ به مدت 10 دقيقه در 10000دور در دقیقه سانتريفوژ شد. ميزان جذب نمونه­ها در طول موج 455 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه­گيری شدند. جذب ساير رنگيزه­هاي غير­اختصاصي در 600 نانو­متر خوانده و از اين مقدار كسر گرديد. براي محاسبه غلظت ساير آلدئيد­ها از ضريب خاموشي معادل mM^-1cm^-110⁵×457/0 استفاده شد. اين ضريب خاموشي ميانگين ضريب خاموشي براي آلدئيد­هاي مورد نظر است .
2-7-5-پراكسيد هيدروژن
5/0 گرم از بافت تازه برگ از برگ­های شاخه اصلی (برگ­های توسعه یافته از گره­های 4 و 5) در پایان آزمایش در هاون چيني حاوي تري­كلرواستيك اسيد 1/0 درصد سرد سائيده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقيقه با بهره گرفتن از دستگاه سانتريفوژ یخچال­دار به مدت 5 دقيقه در 10000 دور در دقیقه سانتريفوژ شد. سپس به 500 میکرو لیتر از محلول رويي، 500 میکرو لیتر بافر فسفات پتاسيم 100 ميلي­مولار (7=pH) و 2 ميلي­ليتر يديد پتاسيم 1 مولار اضافه شد. مخلوط واكنش به مدت 1 ساعت در تاريكي در دماي اتاق قرار داده شد. ميزان جذب نمونه­ها در طول موج 390 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازه­گيری شدند. غلظت پراكسيد هيدروژن با بهره گرفتن از ضريب خاموشي معادل¹ M^-1cm^-28/0 محاسبه و بر حسب میکروگرم در گرم وزن تر گیاهی محاسبه شد .
2-7-6-پروتئین­ محلول کل و سنجش فعالیت آنزیم­ها
2-7-6-1-تهیه بافر استخراج
تهیه بافر فسفات 50 میلی مولار با pH برابر 7 به‌صورت زیر می‌باشد: