به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استانداردهای اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های ۱۰، ۲۰، ۵۰، ۱۰۰، ۱۵۰ و ۲۰۰ و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های ۲۰، ۲۵، ۵۰، ۱۰۰، ۱۵۰ و ۲۰۰ میلیگرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق ۲۰ میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونهها محاسبه شد (چن و همکاران، ۲۰۰۵). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با بهره گرفتن از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل ۳-۴ و ۳-۵).
۳-۸-۳- تزریق نمونه گیاهی
نمونهها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج ۳۳۰ نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان میشود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام میباشد.
شکل ۳-۴- نمودار استاندارد اسید کافئیک
شکل ۳-۵- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
۳-۹- اندازه‌‌گیری روتین با بهره گرفتن از دستگاه HPLC
۳-۹-۱- آماده سازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت ۰۰۱/۰ توزین گردید و در ۱۰ میلیلیتر متانول خالص (۱: ۱۰) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت ۱۰ دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت ۱۲ ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۳۵۰۰ سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل ۵۰ میلیلیتر متانول خالص مرک، ۴۹ میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و ۱ میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای ۲۵ درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلیگرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، ۲۰۰۸؛ سانتوز-گامز و همکاران، ۲۰۰۳).
۳-۹-۲- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های ۲۰، ۵۰، ۱۰۰، ۱۵۰ و ۲۰۰ میلیگرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق ۲۰ میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونهها محاسبه شد (چن و همکاران، ۲۰۰۵). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با بهره گرفتن از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل ۳-۶).
شکل ۳-۶- نمودار استاندارد روتین
۳-۹-۳- تزریق نمونه گیاهی
نمونهها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل ۳-۷). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج ۲۸۵ نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان میشود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.
شکل ۳-۷- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه ۴:۵۰
۳-۱۰- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای میباشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار میباشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت میشود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته میشود.
۳-۱۱- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنیدار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.
۴- نتایج و بحث
۴-۱- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنیدار بود (جدول ۴-۱). جدول ۴-۲ مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
۴-۱-۱- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (۳/۱۴ سانتیمتر) در ارتفاع ۵۰ متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (۹/۶ سانتیمتر) در ارتفاع ۲۲۵۰ متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (۱۶/۹ سانتیمتر) در ارتفاع ۱۰ متری مازندران و کمترین مقدار آن (۵/۵ سانتیمتر) در ارتفاع ۲۲۵۰ متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (۸۵/۱) در ارتفاع ۱۴۵۰ متری گلستان و کمترین مقدار آن (۱۸/۱) در ارتفاع ۲۲۵۰ متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (۷۱/۰=r) دارند (جدول ۴-۳).
جدول ۴-۱- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک
*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح ۵%، ۱% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول ۴-۲- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن
در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.
جدول ۴-۳- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه
*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح ۵%، ۱% و غیر معنیدار میباشد.
۴-۱-۲- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب ۸/۸۴ و ۲/۸۰ عدد بود اما در ارتفاع ۲۲۵۰ متری این تعداد به ۲/۱۹ و ۴/۳۶ عدد کاهش یافت.
۴-۱-۳- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب ۲۳ و ۲/۲۶ عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به ۶/۹ و ۱۱ عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (۴۸/۸ سانتیمتر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع ۱۴۵۰ متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع ۲۲۵۰ متری اختلاف معنیدار نداشت. کمترین فاصله گره (۴/۳ سانتیمتر) در ارتفاع ۵۰ متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (۷۱/۰= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
۴-۱-۴- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب ۰۵/۷ و ۹۸/۶ میلی‌متر بود در ارتفاعات ۱۴۵۰ و ۲۲۵۰ متری گلستان و کمترین مقدار آن (۴۴/۴ میلی‌متر) در ارتفاع ۱۰ متری مازندران مشاهده شد.
