۱

۱

۹۵

۱۵

Melt curve

۲

۱

۶۰

۶۰

۳

۱

۹۵

۱۵

جدول(۳-۸):شرایط دمایی و زمانی واکنش PCRReal-Time
۳-۲-۴-۳-۴- رسم منحنی استاندارد برای هر سه آغازگر

همانطور که اشاره شد،برای تعیین کیفیت یک آغازگر در واکنش Real-Time PCR منحنی استاندارد کشیده می­ شود.مراحل رسم منحنی استاندارد به صورت زیر بود :
برای ایجاد منحنی استاندارد از سری رقّت­های استاندارد با ضریب ۵ استفاده شد،به گونه ­ای که غلظت DNAدر استاندارد شماره ۲ به میزان ۵ برابر کمتر از استاندارد اوّل بود.DNAالگو با غلظت ng.µl^-11/758(گاو شماره ۹۰ در فصل گرم)،در ۵ مرحله رقّت­سازی شد :
- رقّت ۱: ریختن µl 10از DNA با غلظتng.µl^-1 ۱/۷۵۸ در یک ویال ml 2/0(ng.µl^-1 ۱/۷۵۸،µl 10)
- رقّت ۲ : حل کردن µl2از DNA با غلظتng.µl^-1 ۱/۷۵۸ در µl8آب فاقد یون و استریل (ng.µl^-1 ۶۲/۱۵۱،µl 10)
- رقّت ۳ : حل کردن µl2ازDNA با غلظت ng.µl^-162/151 در µl8آب فاقد یون و استریل (ng.µl^-1 ۳۲۴/۳۰،µl 10)
- رقّت ۴ : حل کردن µl2ازDNA با غلظت ng.µl^-1324/30 در µl 8آب فاقد یون و استریل (ng.µl^-1 ۰۴/۶،µl 10)
- رقّت ۵ : حل کردن µl2از DNA با غلظتng.µl^-1 ۰۴/۶ در µl 8آب فاقد یون و استریل (ng.µl^-121296/1،µl 10)
انجام واکنش Real-Time PCR برای هر سه آغازگر در ۵ رقّت سریالی از DNA مورد نظر تحت شرایط جداول (۷-۳) و (۸-۳) .
۳-۲-۴-۳-۵- انجام واکنش Real-Time PCR برای سنجش CT و TMدر هر نمونه
به منظور تعیین میزان الگوی اولیه از کروموزوم­های X و Yو مقایسه نسبت جنسی اسپرم­های ۷ رأس گاو در دو فصل سرد و گرم پس از رسم نمودار استاندارد برای آغازگرها و سنجش کیفیت و بازده آن­ها از این طریق،واکنش Real-Time PCR برای همه نمونه­ها تحت شرایط جداول (۷-۳) و (۸-۳) انجام شد.از آنجایی که هدف ما از انجام این واکنش مقایسه نسبت کروموزوم­های X و Yدر اسپرم­های انزال چند گاو مختلف در دو فصل سرد و گرم است،بایستی تمامی شرایط برای هر ۱۴ نمونه یکسان باشد تا مقایسه بین افراد به جهت بررسی اثر دو عامل تنش گرمایی و تفاوت فردی صحیح باشد.در نتیجه غلظت DNA در تمامی نمونه­ها با دستگاه نانودراپ تعیین و سپس به غلظت ng.µl^-1 ۱۵۰ تعدیل یافت .
۳-۲-۴-۳-۶- آماده ­سازی مخلوط واکنش PCRReal-Time
قبل از هر چیز برنامه مناسب به طور کامل به دستگاه داده­شد . سپس در زیر هود استریل در شرایط نور غیر مستقیم و کم در روی جعبه سرد که از قبل به مدّت دست­کم min 15 در فریزر قرار گرفته­بود، تمامی اجزای واکنش به مقدار محاسبه­شده در ویال­های مخصوص به ترتیب ( مخلوط اصلی واکنش،آب فاقد یون،رنگ ROX،آغازگرها و در انتها DNA )ریخته­شد و در نهایت در دستگاه قرار گرفت.
۳-۲-۴-۳-۷- آنالیز داده ­ها
آنالیز داده ­ها به کمک نرم­افزار StepOne^TM software version 2.2 انجام گرفت. در نهایت خلاصه­ای از روند واکنش و آنالیز­های صورت­ گرفته بر آن از طریق منوی نرم­افزار در رایانه متصل به آن ذخیره شد.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- نتایج حاصل از استخراج DNA سلول­های اسپرمِ۷ رأس گاو در دو فصل سرد و گرم
۴-۱-۱-نتایجالکتروفورزِ DNAِاستخراج­شدهروی ژل آگارز ۱%
DNAِاستخراج­شده با روش نمکی روی ژل آگارز،الکتروفورز شد.همان­طور که در شکل مشاهده می­ شود،باند­ها با هم مشابه و دارای کیفیت مطلوب بودند و از آنها برای PCR کمّی و کیفی استفاده گردید.
شکل (۴-۱) : نتایج حاصل از استخراج DNA ،
(آ)استخراجDNA در فصل گرم ازاسپرم­های مایع منی۷ رأس گاو به شماره­های : ۱- نشانگر DNA(1Kb) 2- 90. 3 - 104. 4- 268. 5- 270. 6- 271. 7-272. 8- 907.(ب)استخراجDNA در فصل سرد ازاسپرم­های مایع منی ۷ رأس گاو به شماره­های : ۱- ۹۰. ۲- ۱۰۴. ۳- ۲۶۸. ۴- ۲۷۰. ۵- ۲۷۱. ۶- ۲۷۲. ۷- ۹۰۷. ۸- نشانگر DNA(1Kb) .
DNA Ladder
(۱Kb)
DNA Ladder
(۱Kb)
۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷ ۸