تردیدی نیست که این پاسخ ایمنی در مقابل زنجیره O مشکلاتی را در تشخیص سرولوژی بروسلوز موجب خواهد شد. بخشی از گاوهای واکسینه با واکسن زنده ۱۹Sتیترهای آنتی بادی راحفظ نموده و تمایز آشکار عفونت طبیعی را از تیتر واکسن در بررسی سرولوژی مانع در ساختار آنتی ژنی لیپو پلی ساکارید سویه های خشن^[۳۴] بروسلا زنجیره O و بالطبع پروزآمین وجود نداشته یا مقادیر بسیار جزئی وجود دارد. از این رو، استفاده از واریانت راف بروسلا آبورتوس با فقدان کامل زنجیره ی پروزامین و قابلیت تولید ایمنی مناسب، ضمن عدم تولید آنتی بادی مداخله کننده در تشخیص سرولوژی طی سال ها مورد توجه پژوهندگان بوده است. رومرو و همکاران( ۱۹۹۴) در سال ۱۹۸۲ سویه ی جهش یافته (موتانت) راف تحت نام RB51 از سویه ی بیماریزا (حاد( ۲۳۰۸ اسموس بروسلا آبورتوس به وسیله ی دکتر گرهاردشوریگ از دانشگاه پلی تکنیک ویرجینیا تولید گردیده و پس از آن توسط پژوهندگان بسیاری مورد بررسی قرار گرفت. از کشت سویه ی ۲۳۰۸ بروسلا آبورتوس پس از ۳ پاساژ در محیط جامد حاوی غلظت های مختلف ریفامپین، پرگنه هایی با خصوصیات مورفولوژی راف ظاهر شده که رنگ کریستال ویوله را جذب نموده و با آکریفلاوین آگلوتینه شد. یکی از این پرگنه ها( RBبروسلا راف )نامگذاری شده و پاساژ های بیشتری روی محیط های حاوی غلظت های مختلف ریفامپین و پنی سیلین داده شد.نتیجتاً دریک مرحله ی سویه یی با شماره RB19 باعدم قابلیت جذب آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی پروزامین زنجیره O لیپوپلی ساکارید بروسلا آبورتوس به ظهور رسید. به منظور تعیین ثبات سویه ی جهش یافته، این سویه چندین بار روی محیط بدون آنتی بیوتیک پاساژ داده شده و در پاساژ نهایی مرتبه ی ۵۱ سویه ی RB51 به دست آمد. این سویه به ریفامپین و پنی سیلین مقاوم بوده و از نظر ساختار آنتی ژنی فاقد پروزامین در لیپوپلی ساکارید خود می باشد. از طرفی دیگر، پروتئین های دیواره ی سلولی سویه ی RB51 مشابه سویه ی والد ۲۳۰۸ است(رومرو و همکاران،۱۹۹۴).
این سویه طی ۹۳ مرتبه پاساژ در محیط آزمایشگاه خارج از بدن موجود زنده و ۱۵ پاساژ روی موش پایدار باقی مانده و هیچگونه تغییر ماهیتی از نظر برگشت پذیری نشان نداده است. بی ضرری و قابلیت ایمنی زایی این سویه در حیوانات مختلف آزمایشگاهی سنجیده شده و سرانجام به عنوان سویه ی واکسن زنده جهت گاو مورد استفاده قرار گرفت.نظر به فقدان پروزامین درساختار آنتی ژنی سویه ی RB51، هیچگونه آنتی بادی ناشی از واکسیناسیون در روش های متداول سرولوژی قابل شناسایی نبوده و بالطبع مشکلی در تشخیص سرمی به وجود نخواهد آورد. درآوریل سال ۱۹۹۶ مجوز تولید واکسن ازسویه یRB51 جهت گاو به وسیله ی وزارت کشاورزی ایالات متحده ی آمریکا صادر شده و شرکت سرم سازی کلرادو مسئولیت تولید آن را به عهده گرفته است. از آن سال به بعد تدریجاً این واکسن جانشین واکسن S19 در بسیاری از کشورهای آمریکا شده است. این واکسن در ایران مورد ارزیابی وسیع قرار گرفته و در حال حاضر به دو شکل دوز کامل بامیزان جرم ۱۰۹x۳۴ ۱۰ در گوساله ها و دوز یک دهم آن در گاوهای بالغ مورد استفاده می باشد(رومرو و همکاران، ۱۹۹۴).
در انسان نیز از واکسن های کشته و زنده ی بروسلوز، و همچنین فراکسیونهای آنتی ژنی بروسلا ها استفاده شده است. ایره^[۳۵]در ۱۹۰۶ برای اولین بار از واکسن کشته ی بروسلا برای واکسیناسیون ۵۱ سرباز در جزیره ی مالت استفاده نمود.نیکول^[۳۶] و کانسیل^[۳۷] در ۱۹۲۳ از واکسن کشته در اثر حرارت و لایو^[۳۸] در ۱۹۵۸ از واکسن کشته با اتر استفاده نمودند.. براود^[۳۹] و همکاران در سال ۱۹۴۹ واکسن کشته در اثر حرارت را به طریق خوراکی به کار گرفتند. تمامی این واکسن ها اثر محافظتی چند ماهه داشته اند. در اتحاد جماهیر شوروی سابق واکسن زنده ی بروسلا از اوایل دهه ی ۱۹۵۰ مورد استفاده قرار گرفت. واکسن از بروسلا آبورتوس( VA19 واریته یی از بروسلا آبورتوس سویه ی ۱۹) تهیه شده و به میزان جرم یک میلیارد به طریق بین جلدی یا ۲۰۰ تا ۳۰۰ میلیون جرم به روش زیر جلدی تجویز می گردید. ایمنی حاصله یک ساله بوده و نیاز به تزریق مجدد داشت.بین سال های ۱۹۵۲ تا ۱۹۵۸ سه میلیون نفر واکسینه شده و میزان بروسلوز انسانی نزدیک به ۶۰% کاهش یافت. در برخی مناطق آلوده میزان بیماری از ۱۰۰ مورد در صد هزار نفر درسال ۱۹۵۲ به میزان صفر در ۱۹۶۵رسید. با وجود این، تلقیح مکرر واکسن زنده واکنش های آلرژیک را موجب شده و واکسیناسیون مجدد به افرادی با واکنش های سرولوژی و آلرژیک منفی محدود گردید. سویه ی C84 بروسلا آبورتوس نیز به طور محدود در شوروی سابق استفاده شد.در چین از سویه ی M104 بروسلا آبورتوس به روش بین جلدی، خوراکی و اسپری داخل بینی استفاده شده و تا حدی رضایت بخش بوده است. با وجود این، تزریق زیر جلدی واکسن مخاطره آمیز بوده وممکن است بروسلوز بالینی را موجب گردد. ظاهراً این واکسن به روش تلقیح خراش پوستی (بین جلدی) در نواحی روستایی هنوز استفاده می شود.اولیتزکی در سال ۱۹۶۰ از سویه ی D19 بروسلا آبورتوس (موتانت سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس) واکسن تهیه نموده و در اسرائیل به طور محدود مورد استفاده قرار داد. همچنین اسپینک از هر دو سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس و Rev1 بروسلاملی تنسیس برای واکسیناسیون انسان درآمریکا به شکل محدود استفاده نمود(ماساری و همکاران،۲۰۰۳).

تعدادی از فراکسیون های آنتی ژنی نیز جهت واکسیناسیون انسان مورد استفاده قرارگرفته اند. مهمترین این واکسن ها به ^[۴۰]PI معروف بوده که ابتدا از بروسلا ملی تنسیس سویه ی M15 و بعد از بروسلا آبورتوس S19 تهیه می شود. هر دو عصاره از خواص بیولوژیک مشابهی برخوردار بوده و حاوی پروتئین ها، قندها و قندهای آمینی (عمدتاً هگزوآمین ها)، پپتید وگلیکان، لپیپد و مقادیر اندکی اسید نوکلئیک می باشد. در حال حاضر این واکسن به شکل تجاری موجود بوده و برای گروه های شغلی تجویز می گردد. واکسیناسیون هر دو سال یک بار و در صورت واکنش آلرژیک پوستی منفی تزریق می شود. واکسیناسیون با دو تزریق یک میلی گرمی PI به فاصله ی دو هفته انجام می پذیرد. اثر محافظتی واکسن پس از ۳۰ روز به حداکثر می رسد. باتاچارجی(۲۰۰۲)
استفاده در احشام بعنوان بخشی از برنامه دولت فدرال برای ریشه کنی تب مالت صادر شد.بروسلا ابورتوس در فوریه ۱۹۹۶ مجوز سازمان بازرسی سلامتی حیوانات واکسن بروسلا ابورتوس سویه RB51 برای سویه RB51 ثبات ژنتیکی دارد.جهش مورفولوژی سخت که فاقد زنجیره های پلی ساکاریدی بر روی سطح باکتری است . این زنجیره جانبی باعث گسترش تشخیص پاسخ انتی بادی یک حیوان به الودگی بروسلا است.بنابراین واکسن سویه RB51 موجب تولید انتی بادی ها بر اساس تست های تشخیصی استاندارد نمی شود. واکسن ما حصل سایر شکلهای انتی بادی هاست که می تواند کشف شود با یک ازمایش ویژه اگر یک حیوان واکسینه شده است این باعث یک پاسخ سلولی می شود که وظیفه اش در درجه اول برای محافظتش در برابر بروسلوز است.سویه RB51 موثرتر از واکسن بروسلا ابورتوس سویه ۱۹ است اما بسیار کمتر در گاوها ابورتیژنیک است.این باعث هیچ گونه علایم بالینی نمی شود پس از واکسیناسیون ، و باعث واکنش موضعی در محل تزریق واکسن هم نمی شود.ارگانیسم از جریان خون ظرف سه روز پاک می شود و در ترشحات بینی و بزاق یا ادرار هم وجود ندارد.ضعف دستگاه ایمنی باعث عود کردن نیست و ارگانیسم از گاوهای واکسینه شده به گاوهای واکسینه نشده گسترش نمیابد. واکسن در همه ی گاوهایی که بیش از سه ماه عمر دارند بی خطر است .در صورتی که انسان در معرض آن قرار گیرد سویه RB51به طیف وسیعی از آنتی بیوتیکهای مورد استفاده در بروسلوزیس انسانی حساس است اما به ریفامپین و پنی سیلین مقاوم است.(فرپش و همکاران،۲۰۰۰)
واکسن سویه RB51باید توسط دامپزشک معتبر تجویز شود یا توسط اداره ایالتی یا فدرال سلامتی حیوانات.گوساله ها باید با دوز گوساله بین سن چهار ماهگی تا یک سالگی واکسینه شوند.( فرپش و همکاران،۲۰۰۰)
بتز و همکارانش نشان دادند که LPS بروسلا آبورتوس باعث القای IFN-γ از لنفویست های T میشود و وندورگ و هم کارانش از OMPs نایسریا مننژیتیدیس گروه B به عنوان ادجوانت برای LPS بروسلا ملی تنسیس در مدل حیوانی استفاده کردند و نشان دادند که استفاده از کمپلکس OMP مننگوکوک با LPS بروسلا ملی تنسیس باعث تحریک ۱ Th و انتی بادی های IgG2a می شود.بتس(۱۹۹۳)؛ون و همکاران(۱۹۹۶۹) باتاچارجی و همکارانش از کمپلکس LPS بروسلا ملیتنسیس با پروتئین های غشای خارجی نیسریا مننژیتیدیس سروگروه B برای ایمن سازی در موش استفاده کردند و انتشار باکتری به طحال و کبد را مهار نمودند (باتاچارجی،۲۰۰۲).
در تحقیقات گولدینگ^[۴۱] و همکاران مشخص شد که سمیت لیپوپلی ساکارید بروسلا آبورتوس در آزمایشات کشندگی در موش و تب زایی درخرگوش از لیپوپلی ساکارید E.coli بسیار کمتر است و تعداد واحد اندوتوکسین یک میلی گرم لیپوپلی ساکارید بروسلا آبورتوس از یک میلی گرم لیپوپلی ساکارید E.coli کمتر می باشد (۸۶) . در روش بوتانلی استخراج لیپو پلی ساکارید باکتری بروسلا آبورتوس S99 توسط ان-بوتانل اشباع شده با آب به روش موریسون^[۴۲] و لوییس^[۴۳] که اخیرا توسط فیلیپس^[۴۴] و همکارانش بهینه شده انجام گرفت(۱و۵).لیپو پلی ساکارید استخراج شده با متانول سرد (۴حجم) رسوب داده شده و دوباره با متانول سرد شستشو گردید.سپس در دور g100000 با اولترا سانتریفوژ رسوب داده شده ولیوفلیزه گردید.موریسون و همکاران(۱۹۷۵)؛گولدینگ و همکاران(۱۹۹۲)؛آپیسلا و همکاران(۱۹۹۴) این روش بدلیل عدم آسیب به سلولهای باکتریایی وعدم تخریب انها بعنوان استخراج ملایم در نظر گرفته شده است. در روش فنلی لیپوپلی ساکارید بروسلا ابورتوس و E.coli (O157) با روش وست فال^[۴۵] استخراج میگردد. بر خلاف پلی ساکاریدهای کپسولی زیر گروه های A و C که ایمونوژن های پر توانی هستند , پلی ساکارید کپسولی زیر گروه B سیستم ایمنی اختصاصی بدن را تحریک نمی کند (مورلی و همکاران،۲۰۰۲؛علاالدین،۱۹۹۶؛فرپش و همکاران،۲۰۰۰).
این نقص مولکولی به دلیل تشابه ساختمان شیمیایی آن با اسفنگولیپیدها و سیالوگانگلیوزیدهای موجود در سیستم اعصاب مرکزی است.رومرو(۱۹۹۴) به همین دلیل در دو دهه گذشته جهت جایگزینی زیر واحد ایمونوژن دیگری نظیر پروتئین های عمده غشای خارجی دیواره سلولی (OMPs ) نیسریا مننژیتیدیس زیر گروه B فعالیت های تحقیقاتی گسترده ای انجام گرفته است. در اواخر سال ۱۹۸۹ سیرا و همکاران او توان حفاظتی OMPs نیسریا مننژیتیدیس زیر گروه B را در حیوانات ازمایشگاهی به اثبات رسانیدند و در سال های ۱۹۹۰-۱۹۹۱ بوژنه و همکارانش واکسن های زیر واحد پروتئینی استخراج شده از غشای خارجی دیواره سلولی را برای کنترل شیوع اپیدمیک مننژیت مننگوکوکی تحت نظارت موسسه بین المللی بهداشت عمومی نروژ مورد ارزیابی قرار دادند که با موفقیت همراه بود(رومرو و همکاران،۱۹۹۴).
تومیسین و همکاران او در سال ۱۹۹۰ در یک طبقه بندی اولیه اصلی ترین پروتئین های غشای خارجی را به پروتئین های کلاس ۱ تا ۴ تقسیم کردند. پولارد و همکاران(۲۰۰۱)؛ماساری و همکاران(۲۰۰۳) کلاس I پروتئین ها (پورین PorA) 45 کیلودالتون وزن داشت د ر تمام مننگو کوک ها بیان می شوند. پروتئین های کلاس II و III نیز پورین هایی با وزن مولکولی ۳۷ تا ۴۲ کیلو دالتون هستند. پروتئین های کلاس IV با وزن مولکولی ۳۷ تا ۴۳ کیلو دالتون پروتئین های القایی بوده در اتصال به آنتی بادی بلو کان نقش دارند. تخلیص مجموعه ای از پروتئین های غشای خارجی سویه های فاقد پروتئین کلاس III و ارزیابی پاسخ های ایمنی زایی در مدل های حیوانی حاکی از عدم تغییر در میزان آنتی باری باکتریسیدالی تولید شده در حیوان است در حالی که موتاسیون درژن تولید کننده کلاس I کاهش شدیدی را در تیتراین آنتی بادیها ایجاد می کند که نشان از نقش غالب پروتئین های کلاس I در تولید آنتی بادی باکتریسیدالی دارد. آریجیتا و همکاران(۲۰۰۴)؛جانسن و همکاران(۲۰۰۰)؛لی و همکاران(۱۹۹۲)؛ورمت و همکاران(۲۰۰۲) بنابراین امکان استفاده از پروتئین های عمده و غشای خارجی زیر گروه B به ویژه پروتئین های کلاس I که هم در سایر ایمنوتایپ های نیسریا مننژیتیدیس بیان می گردد و هم عمده ترین آنتی ژن در القا آنتی بادی های باکتریسیدالی سرم خون است به عنوان واکسنی مفید و موثر مونووالانت یا کونژوگه دو ظرفیتی توجه محققان را به خود جلب کرده است جانسن و همکاران(۲۰۰۰)؛علاالدین و همکاران(۱۹۹۶)؛مورلی و همکاران(۲۰۰۲)؛فرپش وهمکاران(۲۰۰۰)رمرو(۱۹۹۴)؛سوامیناتان و همکاران(۱۹۹۶).از آن جا که گروه های کلیدی در فرایند خط تولید صنعتی و زیکول غشای خارجی حاوی PorA رازی است تجاری و در انحصار کمپانی های بزرگ چند ملیتی، مراحل مختلف تحقیق حاضر حول محور دستیابی به میزان قابل توجهی از این پروتئین که با حفظ فرم فضایی طبیعی خود توان حفاظتی بالایی را در بزرگسالان، کودکان و نوزادان ایران حفظ کند، پایه ریزی گردیده است. کلاسن و همکاران او نیز دریافتند که بین چهار کلاس I و II و III و IV پروتئین های عمده غشای خارجی دیواره سلولی نیسریا مننژیتیدمیس زیر گروه B ،کلاس I (porA) سیستم ایمنی اختصاصی بدن را نسبت به سایر پروتئین های غشای خارجی فعالانه تر تحریک میکند. مطالعه porA در سطح مولکولی نشان می دهد که ژن مسئول سنترآن نه تنها در شرایط کنتر ل شده کشت غوطه ور به خوبی فعال است؛ بلکه در تمام زیر گونه های مختلف نیسریا مننژیسیدیس به ویژه زیر گروه B به طرز قابل توجهی بیان می شود. به علاوه این ژن پایدار بوده، به ندرت در معرض جهش خود به خودی قرار می گیرد. با توجه به بالا بودن تعداد آن در سطح خارجی باکتری نسبت به سایر پروتئین های غشای خارجی دیواره، توان حفاظتی آن نیز بسیار قابل توجه است. (لی و همکاران،۱۹۹۲؛کلاسن و همکاران،۱۹۹۶)
از آن جا که دانش فنی مراحل مختلف تولید نیمه صنعتی و صنعتی واکسن زیر واحد مدرن امروزی در انحصار کمپانی های بزرگ چند ملیتی قرار دارد، در تحقیقات حاضر با بهره گیری از تجارب سایر محققان فن و بهینه سازی سنتیک رشد در کشت غوطه ور، امکان تولید نیمه صنعتی OMV-porA خالص زیر گونه استاندارد نیسر یا مننژیسیدیس زیر گروه B (CSBPI:G245) در ایران مورد ارزیابی قرار گرفت به طوری که از کشت ۴۰ لیتر محیط فرانتز اصلاح شده در شرایط کنترل شده اپتیمم در فرمانتور ۷۵۰ میلی گرم OMV-PorA خالص بدست آمده که نسبت به روش کلاسن و همکاران او ۱۰درصد افزایش تولید را نشان می دهد. بررسی میکروگراف الکترونی نیز نشان می دهد که بیش از ۶۰ تا ۸۵ درصد وزیکول I شکل فضایی طبیعی خود را حفظ کرده، در مراحل مختلف فرایند خالص سازی، سالم مانده اند.در اواخر سال ۱۹۸۹سیرا و همکاران او توان حفاظتی OMPS نیسریا مننژیتیدیس زیر گروه B را در حیوانات ازمایشگاهی به اثبات رسانیدند و در سال های ۱۹۹۱-۱۹۹۰ بوژنه و همکارانش واکسن های زیر واحد پروتئینی استخراج شده از غشای خارجی دیواره سلولی را برای کنترل شیوع اپیدمیک مننژیت مننگوکوکی تحت نظارت موسسه بین المللی بهداشت عمومی نروژ مورد ارزیابی قرار دادند که با موفقیت همراه بود.(رومرو و همکاران،۱۹۹۴)
کلاسن و همکاران در سال ۱۹۹۶ ، روش دزوکسی کولات OMV اولتراسانتریفوژ افتراقی را برای استخراج و تخلیص پایه ریزی نمودند. آنها مقدار مناسبی از OMV حاوی PorA را از نیسریا مننژیتیدیس سروگروه B به دست آوردند. این گروه از محققان نشان دادند که از بین ۴ کلاس عمده پروتئین های غشاء خارجی نیسریا مننژیتیدیس، کلاس ۱،(PorA) سیستم ایمنی اختصاصی را نسبت به سایر پروتئینهای غشاء خارجی بیشتر تحریک میکند ( ۱۲۳). سیادت و همکاران در سال ۱۳۹۰، با بهره گرفتن از تجربیات به دست آمده، به استخراج و ارزیابی های فیزیکوشیمیایی OMV نیسریامننژیتیدیس سروگروه A پرداختند.(سوامیناتان و همکاران،۱۹۹۶)
فصل سوم
مواد و روش­ها
۳-۱- وسایل مورد استفاده :
پلیت یکبار مصرف Farazbin, Iran))
ترازو (Electronic Balance,)
دستگاه pH متر (Jenway fx-320,)
یخچال (الکترواستیل، ایران)
فریزر ( Samsung, South Korea)
شیکر لوله (IKA Vortex Genius3)
انکوباتور شیکردار (Heidolph unimax 1010, Germany)
انکوباتور (پارس طب نوین، ایران)
اتوکلاو (پارس طب نوین، ایران)
میکروسکوپ (Nikon Eclipse E100)
اسپکتوفتومتر (Biowave DNA, UK)
ست ۳ تایی سمپلر متغیّر (شرکت Extragene)
ست الکتروفورز ژل آگاروز (Major science, Malaysia)
دستگاه ترمال سایکلر (Peqlab, UK)
دستگاه سانتریفوژ (Hettich EBA20, Germany)
دستگاه میکروفیوژ (Eppendorf, Germany)
دستگاه نشانگر ژل (Gelve Ultraviolet Transilluminator)
بن ماری (پارس طب نوین، ایران)
میکروتیوب (Extragene, USA)
لوله فالکون ۱۵ ml و۵۰ ml (Extragene, USA)
سرسمپلر در سه سایز (Extragene, USA)
هود لامینار (Beasat, Iran)
فیلتر غشایی ۰.۴۵μm و ۰.۲۲ μm استریل
ترمومتر جیوه­ای
Hot Plate (Heidolph, Germany)
Cold Incubator (پارس طب نوین، ایران)
و سایر وسایل معمول آزمایشگاه
۳-۲ مواد مورد استفاده