۳-۲-۱۵- فیلتراسیون سوپرناتانت
حدود ۵۰۰ سی سی سوپرناتانت حاصل شد که توسط فیلتر هولدینگ و با قطر منافذ ۴۵/۰ میکرون، فیلتراسیون انجام شد.
۳-۲-۱۶- لیوفلیزاسیون
برای حفظ پایداری و ماندگاری طولانی مدت، PRP تخلیص شده باید لیوفلیزاسیون شود. به این منظور محلول حاصل، در حجم‌های ۲ میلی لیتردر ویال‌های کوچک تقسیم شد و برای لیوفلیزاسیون به بخش تولید انستیتوپاستور فرستاده شد.

۳-۲-۱۷- تعیین خلوص PRP تخلیص شده :
نمونه های تخلیص شده PRP برای تعیین خلوص و مقایسه با PRP استاندارد با روش طیف سنجی NMR و FTIR به بخش شیمی فیزیک دانشگاه تهران ارسال شد.درصد خلول PRP به عنوان پلی ساکارید مورد استفاده در کونژوگاسیون از اهمیت ویژه ای برخوردار است.زیرا هرچه خلوص بیشتر باشد اتصال پلی ساکارید با کریر پروتئینی بهتر انجام می گیرد.
۳-۲-۱۸- تست ریبوز
سنجش ریبوز و PRP بر اساس تست بیال انجام شد. (آشول و همکاران، ۱۹۵۷)
۳-۲-۱۸- ۱- اساس تست بیال
ریبوز جزء قندهای ۵ کربنه (پنتوز) محسوب می‌شود، در این روش می‌توان هگزوزها و پنتوزها را از هم تشخیص داد و روشی اختصاصی برای تشخیص پنتوزها می‌باشد.
پنتوزها در مجاورت اسیدکلریدریک غلیظ، آب از دست داده، فورفورال تولید می‌کنند، فورفورال با اورسینول به کمپلکس با رنگ سبز مایل به آبی تبدیل می‌شود. ( آشول و همکاران، ۱۹۵۷).
۳-۲-۱۸- ۲- معرف‌های تست بیال :
اورسینول
اسید هیدروکلریک غلیظ
فریک کلرید
اتانول
۳-۲-۱۸- ۳-محلولها و ترکیبات :
A- محلول ۱۰% فریک کلرید (Fecl3) در اسید کلریدریک (۱۲ نرمال)
B- محلول ۱۰٪ اورسینول- اتانول (۹۵ درصد)
C- محلول ۱۰٪ استوک ریبوز
۳-۲-۱۸- ۴-تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز :
ابتدا حدود ۲۵ میلی گرم از ریبوز استاندار (مرک) را برداشته و در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل می‌کنیم (استوک۱)، سپس ۱ میلی لیتر از استوک ۱ را برداشته و حجم آن را با آب مقطر به ۱۰ میلی لیتری می‌رسانیم، سپس به میزان ۱/۰، ۲/۰، ۴/۰، ۶/۰، ۸/۰، ۱ میلی لیتر از استوک ۲ برداشته و سپس با آب مقطر حجم همه‌ی تیوپ‌ها را به ۲ میلی لیتر می‌رسانیم. سپس به همه‌ی لوله‌ها ۲ میلی لیتر از محلول gl5/0 کلریدفریک در اسید کلریدریک اضافه می‌کنیم، هم‌چنین به همه‌ی تیوپ‌ها ۲/۰ میلی لیتر از محلول grl100 اورسینول در اتانول اضافه می‌کنیم. سپس هر ۶ تیوپ را به مدت ۲۰ دقیقه در حرارت ۱۰۰ درجه سانتیگراد قرار می‌دهیم. (شکل ۳-۱۱ )بعد از ۲۰ دقیقه بلافاصله تیوپ‌ها را در آب سرد قرار می‌دهیم. بعد از آن جذب نوری هر ۶ تیوپ را در ۶۷۰ نانومتر قرائت کرده و بر اساس آن منحنی استاندارد ریبوز را رسم می‌کنیم.
ب الف
شکال۳-۶- تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت)
۳-۲-۱۸- ۵- آماده سازی PRP تخلیص شده
حدود ۱ میلی گرم از PRP لیوفلیزه شده را برداشته و در ۴۰ میلی لیتر آب مقطر حل می‌کنیم، سپس حدود ۲/۰ میلی لیتر از این محلول را برداشته و مراحل زیر را به ترتیب عمل می‌کنیم:
۱- حجم محلول را با آب مقطر به ۲ میلی لیتر می‌رسانیم.
۲- اضافه کردن ۲ میلی لیتر از محلول gl5/0 کلریدفریک در اسید کلریدریک
۳- اضافه کردن ۲/۰ میلی لیتر از محلول grl100، اورسینول در اتانول
۴- قرار دادن تیوپ در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ دقیقه
۵- قرار دادن تیوپ در آب سرد
۶- قرائت جذب نوری تیوب ها در ۶۷۰ نانومتر
۷- پس از رسم نمودار استاندار ریبوز، میزان ریبوز در نمونه‌ی PRP تخلیص شده بر حسب میکروگرم در میلی لیتر محاسبه شد. (آشول و همکاران، ۱۹۵۷)
۳-۳-۱- آزمون های پروتئین سنجی
چهار روش به طور روتین برای تعیین غلطت پروتئین ها در یک محلول استفاده می شود. این روش ها شامل یک روش بر اساس جذب طبیعی اشعه ماورا بنفش بوده و در سه روش دیگر، رنگ پروتئین ها تغییر پیدا می کند. این روش ها شامل، آزمون Lowry، آزمون Smith Copper/Bicinchoninic، و آزمون سنجش رنگی Bradford می باشد. با وجود این که یکی یا چند روش اشاره شده در آزمایشگاه های بیوشیمیایی مورد استفاده قرار می گیرند،اما انجام هیچ کدام از آنها به طور خاص ، به دلایل زیر به سادگی امکان پذیر نمی باشد.
در روش اول ، که جذب UV بوده، به یک پروتئین خالص که دارای ضریب (؟) بالایی است که در یک محلول عاری از مواد مداخله گروجود دارد، نیاز داریم. غلطت یکک پروتئین در یک محلول، به طور تقریبی می تواند توسط معادله های زیر برآورد شود:
A₂₈₀ = ۱ A (mL/cm mg) x [Conc.] (mg/mL) x 1 (cm)
A₂₀₅ = ۳۱ A (mL/cm mg) x [Conc.] (mg/mL) x 1 (cm)
پروتئین های مختلف دارای ضریب های شکست مختلفی در ٢٠۵ و ٢٨۵ نانومتر هستند، و غلظت های بدست آمده به این روش باید با دقت زیادی مورد بررسی قرار گیرند. پس به طور خلاصه در این آزمون، محلول پروتئینی باید فاقد مواد جاذب UV دیگر باشد، و تمامی سنجش ها باید در کووتی از جنس کوارتز انجام گیرند.
در روش های Lowry و Copper/bicinchoninic، اساس واکنش بر احیا شدن Cu2+ به Cu1+ توسط آمید ها می باشد. با این که این روش ها نسبتا دقیق هستند، اما به محلول سازی های زیادی نیاز دارند، که باید در زمان انجام آزمایش تهیه شوند. سپس، انکوباسیون باید با اختلاف دمای کم و کنترل شده ای انجام شود و فورا میزان جذب محلول های نا پایدار نیز باید خوانده شود. هر دو آزمون تحت تاثیر مواد فراوان موجود دیگر در محلول، مثل دترجنت ها، لیپید ها، بافرها و احیا کننده قرار می گیرند. هم چنین این آزمون ها نیاز به تهیه رقت های سریالی دارند، اما در هر آزمون، نیاز به رقت های مختلفی از پروتئین نمونه می باشد.
روش رنگی Bradford بر اساس تشکیل تعادل بین ٣ حالت مختلف از ربگ کوماسی بلو است.نحن شرایط سخت اسیدی، رنگ بیشترین پایداری را از خود نشان می دهد و به صورت قرمز پر رنگ
(double protononated) در می آید. پس از اتصال به پروتئین ها، بیشترین پایداری در رنگ آبی پر رنگ (unprotonated) دیده می شود.
Protein
Red <=======> Green <========> Blue <=======> Blue-Protein
(۴۷۰ nm) H⁺ (۶۵۰ nm) H⁺ (۵۹۰ nm) (590 nm)
۳-۳-۲روش برادفورد
روشی سریع، دارای مراحل محلول سازی کمتر، بدون نیاز به حرارت دادن، و دارای پاسخ رنگی مطمئن تری نسبت به روش های دیگر است. اما مانند روش های دیگر، به موادی غیرپروتئینی، مثل دترجنت ها نیز پاسخ می دهد. هم چنین، بسته به غلطت پروتئین موجود، میزان پاسخ رنگی هم تغییر پیدا می کند. به همین دلیل، انجام سنجش های پروتئینی استاندارد اهمیت دارد.
محلول های به کار رفته در روش های پروتئین سنجی قابل دسترس و آماده هستند. روش های اصلاح شده ای نیز وجود دارند که در متن به آنها اشاره شده است.
۳-۳-۳- روش پروتئین سنجی Lowry
در این روش، ٢ واکنش شیمیایی اساسی رخ می دهد: در واکنش اول، یون Cu+2 با مولکول های پروتئینی وارد واکنش می شود. در نتیجه، یک کمپلکس پروتئین- مس دو ظرفیتی را به وجود می آورد. در واکنش دوم، اسید فسفو تنگستیک و اسید فسفو مولیبدیک از محلول فولین باعث ایجاد رنگ خاصی در کمپلکس فوق می شود. در کمپلکس پروتئین- مس دو ظرفیتی، اسید آمینه تیروزین و تریپتوفان احیا می شوند و غلظت رنگ آبی محلول به میزان پروتئین موجود بستگی دارد. حساسیت این روش، بین mg/ml ٣٠٠-١ است.
محلول های مورد نیاز برای انجام روش Lowry:
محلول A: شامل ٢٠ گرم Na2CO3 و ۵ گرم تارتارات سدیم-پتاسیم است که در ١ لیتر سود M ١/٠ حل می شود.
محلول B: ۵ گرم سولفات مس آبدار ۵ ظرفیتی (CuSO4, 5 H2O)را به محلول سیترات سدیم M ٠١/٠ افزوده، و با آب مقطر به حجم ١ لیتر رسانده می شود.